铜绿假单胞菌对碳青霉烯耐药机制：耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药机制及同源性研讨

韦柳华

[摘要] 意图 剖析柳州市4所医院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药机制及同源性，为辅导临床合理用药、操控感染供给依据。 办法 69株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌别离自柳州市工人医院（甲医院），中医院（乙医院）、妇幼保健院（丙医院）和柳铁中心医院（丁医院）。选用纸片分散法及微量肉汤稀释法进行药敏实验，选用脉冲场凝胶电泳（PFGE）剖析菌株同源性，聚合酶链反响（PCR）检测β-内酰胺酶基因和OprD2基因，运用氰氯苯腙（CCCP）进行自动外排泵挑选实验。 成果 69株铜绿假单胞菌对多黏菌素B和氨基糖苷类的耐药率较低，对头孢他定、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率别离为40.6%、40.6%、44.9%，其他抗菌药物的耐药率均>50%；β-内酰胺酶基因IMP阳性率为4.3%，OprD2基因阳性率为63.8%，VIM、KPC、GIM、OXA和SPM基因均未检出；自动外排表型阳性率为82.6%。PFGE分型分为A～J共10个基因型，其间A型为首要基因型，占44.1%；4所医院均存在克隆传达，甲、乙、丙、丁医院别离以A型、H型、D型、C型克隆株传达为主，甲、乙医院有一起的B型克隆株存在，甲、丁医院有一起的A型克隆株存在。 定论 克隆株在医院内、医院间播散已成为柳州市耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌别离率不断上升、菌株不断添加的首要原因，自动外排泵高表达、OprD2蛋白表达缺失和产IMP型金属酶是该菌对碳青霉烯类药物耐药的首要机制。

[关键词] 铜绿假单胞菌；耐药机制；同源性

[中图分类号] R378.99+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）04（b）-0004-04

[Abstract] Objective To analyze drug resistance and homology of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa of four hospitals in Liuzhou city for providing the basis of the clinical rational use of drugs and controling infection. Methods 69 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa were isolated from Worker′s Hospital （A Hospital），Hospital of Traditional Chinese Medicine （B Hospital）， Maternal and Child Health Hospital （C Hospital） and Liu Railway Central Hospital （D Hospital）.Drug sensitive test was conducted by by disk diffusion and broth micro dilution，the homology of bacterial strain was analyzed by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE），gene of β-lactamase and OprD2 was detected by PCR，active efflux pump screening test was conducted by CCCP. Results In 69 strains of Pseudomonas aeruginosa，drug resistance rate of polymyxin B and aminoglycoside was lower，ceftazidime，cefoperazone / shubatan and piperacillin/tazobactam was 40.6%，40.6%，44.9% respectively，other antibiotic′s resistance rate was >50%；the positive rate of β-lactamase gene IMP was 4.3% and the positive rate of OprD2 was 63.8%，strains positive for gene VIM，KPC，GIM，OXA and SPM were not detected；the positive rate of active efflux phenotype was 82.6%.There were 10 genotype by PFGE named A-J，the major A type was 44.1%；four hospitals（ A，B，C and D Hospital） all contained clone transmission and clone strain transmission of A，B，C and D Hospital was mainly type A，type H，type D，type C respectively，both A and B Hospital exsited type B clone strain，both A and D Hospital existed type A clone strain. Conclusion Clone strain spread in the hospital and among hospitals has become the main reason of the isolated rate of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa rising，and strain increasing in Liuzhou city，the main mechanism of drug resistance of Pseudomonas aeruginosa to carbapenem drugs was high expression of active efflux pump，OprD2 protein expression loss and production IMP type metal enzyme.

[Key words] Pseudomonas aeruginosa；Drug resistance mechanism；Homology

近年来，跟着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的广泛运用，在药物的挑选压力下，耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的别离率也在不断增高[1-4]，给临床抗感染医治带来极大的应战。本研讨对柳州市4所医院临床别离的69株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌进行耐药性、同源性及碳青霉烯类抗生素相关耐药基因和自动外排泵机制剖析，以开始说明引起医院内感染菌株的耐药机制和同源性。

1 资料与办法

1.1 资料

1.1.1 菌株来历 69株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌均为2010年1月～2012年3月柳州市4所三级甲等医院住院患者送检标本中别离所得，同一患者屡次别离到的菌株不重复计入，其间工人医院（甲医院）50株，中医院（乙医院）7株、妇幼保健院（丙医院）8株、柳铁中心医院（丁医院）4株。细菌断定和药敏实验的质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853和大肠埃希菌ATCC 25922，脉冲场电泳Marker所用菌株为Braenderup血清型的沙门菌H9812。

1.1.2 首要仪器 CHEF Mapper 脉冲场凝胶电泳仪和凝胶成像体系（Bio-Rad，美国）、Microscan Autoscan-4微生物剖析仪（西门子公司，德国）、Vitek2 Compact全自动微生物剖析仪（生物梅里埃公司，法国）、ABI 7300 PCR仪（ABI，美国）。

1.1.3 首要试剂 NC31 型检测板（西门子公司，德国），GN卡和E-test试条（生物梅里埃公司，法国），限制性内切酶SpeⅠ、XbaⅠ（Promega ，美国），SeaKem Gold 脉冲场凝胶电泳琼脂糖（CAMBREX，美国），蛋白酶K（MERCK，德国），十二烷基肌氨酸钠、Tris缓冲液、EDTA、硼酸等（Sigma，美国），氰氯苯腙 CCCP（Sigma，美国），抗菌药物纸片（OXOID，英国），PCR试剂（上海英潍交易有限公司）。

1.2 办法

1.2.1 细菌断定和药敏实验 选用Microscan Autoscan-4和Vitek2 Compact微生物剖析仪进行细菌断定。选用纸片分散法（K-B法）及微量肉汤稀释法进行药敏实验，按CLSI 2012年规范[5]判别成果。

1.2.2 β-内酰胺酶基因与OprD2基因检测 选用PCR检测VIM基因、IMP基因、KPC基因、GIM基因、OXA基因、SPM基因和OprD2基因。DNA模板制备、引物序列、PCR反响体系及反响条件详见参考文献[6]。扩增产品送上海英潍交易有限公司测序，测序成果在GenBank上经BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）比对剖析，断定基因型。

1.2.3 自动外排泵挑选实验 制造水解酪蛋白（M-H）琼脂和含CCCP（终浓度70 mg/L，该浓度对外排泵有较好的抑制效果，而对细菌成长无影响）的M-H 琼脂平皿，挑取2～3个过夜培育的菌落，用生理盐水调至0.5麦氏单位，依照K-B法操作涂布菌悬液和张贴亚胺培南E-test试条，放35℃培育24 h，调查CCCP对亚胺培南的MIC的反转效果。当存在CCCP时亚胺培南的MIC比缺少时相应的MIC下降至原值的1/4或更低，则判别为外排泵阳性株，提示自动外排机制存在。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳 从69株铜绿假单胞菌中挑选出34株细菌进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）。具体操作：铜绿假单胞菌经细胞裂解液和蛋白酶裂解后，用内切酶SpeⅠ过夜消化凝胶栓中的基因组DNA，然后凝胶栓嵌入1%琼脂糖凝胶，将琼脂糖凝胶放入电泳槽中电泳。电泳参数：脉冲时刻6.75～35.38 s，电泳时刻20 h，温度14℃，电场夹角120°，电场强度6 V/cm。沙门菌 H9812作为电泳分子量符号 Marker。然后在EB溶液中染色30 min，纯水脱色1 h，在凝胶成像体系调查并照相。所取得的图画用BioNumerics 6.6软件导入指纹图谱库，运用该软件的clustering 功用，依据条带的差异，用UPGMA法进行聚类剖析。PFGE的判读按美国疾病操控和防备中心Tenover等[7]的肉眼断定规范，并结合BioNumerics软件剖析的UPGMA法[8]。①无法区别：肉眼0条带不同，UPGMA法为100%类似；②严密相关型：肉眼2～3条带不同，UPGMA法类似度为80%以上；③有可能有关：肉眼4～6条带不同，UPGMA法类似度为80%以上；④不同：肉眼≥7条带不同，UPGMA法类似度为80%以下。①、②和③被判别为有克隆相关性，可归为同一克隆，如A克隆，其间①为A1亚型，②和③别离命名为A2亚型，A3亚型。

1.3 统计学处理

运用WHONET 5.6软件对药敏成果进行剖析，运用SPSS 13.0软件剖析数据。

2 成果

2.1 药敏实验

多黏菌素B、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素对该菌坚持较强的抗菌活性，耐药率别离为0、11.6%、20.3%、21.7%，其次为头孢他定、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦，耐药率别离为40.6%、40.6%、44.9%（表1）。

2.2 耐药基因检测

69株铜绿假单胞菌中，仅3株检测出IMP 基因，阳性率为4.3%，测序为IMP-1型金属酶基因（GenBank登录号：AB472901.2），OprD2基因缺失44株，阳性率为63.8%，其他耐药基因（VIM、KPC、GIM、OXA和SPM）均未检出。

2.3 自动外排泵挑选实验

在CCCP效果下，69株铜绿假单胞菌中有57株细菌对亚胺培南的MIC下降至原值的1/4或更低，自动外排表型阳性率为82.6%。