多糖与蛋白质结合 裂褶菌子实体中多糖及蛋白质含量的测定
孙鹏珍+刘月+王大可+李爱欣+王淑敏
[摘要]意图 树立裂褶菌子实体中多糖、蛋白质含量的测定办法。 办法 选用分光光度法测定多糖和总蛋白含量，检测波长别离为479nm和595nm。 成果 多糖浓度在0.012～0.040mg/mL范围内具有杰出的线性关系，回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为7.26%；蛋白浓度在0.0078～0.0321mg/mL范围内具有杰出的线性关系，回归方程为Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为0.2631%。 定论 本研讨树立的办法简洁、快速、精确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定供给了根据。
[关键词] 裂褶菌；多糖；蛋白质；含量测定
[中图分类号] TQ461 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）23-74-04
裂褶菌（Schizophyllum commne Fr.）又称白参、树花、八担柴，隶属于真菌门（Eumycophyta），担子菌纲（Basidiomycetes），伞菌目（Agaricales），裂褶菌科（Schizophyllaceae），裂褶菌属（Schizophyllum），食用有补养、强身的效果[1]。近年来，日本及欧美等国在分子生物学、抗癌活性物质和优秀菌株的选育等方面进行了广泛的研讨[2-4]，我国李梦杰等[5]对其培育研讨并别离出了产漆酶的裂褶菌GGHN08-104菌株。裂褶菌子实体中含有多种活性成分，郭孟璧等[6]对裂褶菌挥发油的化学成分进行了研讨，成果判定出（Z，Z） -9，12-十八二烯酸等12种化学成分，毛绍春等[7]用硅胶柱重复层析从子实体中别离出了麦角甾醇等多种化合物。药用真菌现在研讨最多的是真菌多糖，裂褶菌多糖可增强巨噬细胞的吞噬活性，对巨噬细胞、天然杀伤性细胞有激活效果，能进步白细胞介素发生才能[8]，对体外培育的人肝癌HepG2、Bel-7402及喉癌Hep-2细胞的成长繁衍具有明显的抑制效果[9]，所以其子实体中多糖含量能够作为裂褶菌食药用价值凹凸的目标之一。王凤仙等[10]测定出裂褶菌子实体中含有15种氨基酸，赵琪等[11]总述裂褶菌能发生多种酶，所以对其蛋白质含量测定也能够衡量其食药用价值的凹凸。本研讨树立了裂褶菌子实体中多糖和蛋白含量的测定办法，具有必定的理论和实际意义。
1 仪器与资料
紫外-可见分光光度计（UV2450日本岛津），葡萄糖对照品、牛血清蛋白对照品（购于北京索莱宝科技有限公司），裂褶菌子实体（采于长春中医药大学校园）。
2 办法与成果
2.1 子实体多糖含量的测定[12]
选用3，5—二硝基水杨酸定糖法测定裂褶菌子实体中多糖的含量。
2.1.1 对照品溶液的制备 精细称取105℃枯燥至恒重的无水葡萄糖规范品25mg，置25mL容量瓶中加水定容至刻度，即得1mg/mL葡萄糖的规范品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 （1）供试品溶液的制备：精细称取子实体粉末2.5081g，加热回流提取3次，每次30min，兼并滤液并浓缩，定容至50mL量瓶中，即得。作为总糖供试品和还原糖供试品备用。（2）总糖供试液的制备：精细量取供试品溶液2mL，置25mL容量瓶中，加6N盐酸8mL，置沸水浴加热30min，冷却，加1滴酚酞指示剂，用40%氢氧化钠溶液中和至微赤色，加水定容至刻度，即得总糖供试液。（3）还原糖供试液制备：即为上述供试品溶液。
2.1.3 办法学调查
2.1.3.1 线性关系调查 精细量取葡萄糖标品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL别离置于25mL容量瓶中，均加蒸馏水至2mL，再参加1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂溶液，水浴5min，定容至刻度，摇匀。479nm波长下测定样品吸光值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作规范曲线，求得回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，葡萄糖在0.0120～0.0400mg/mL范内呈杰出的线性关系。
2.1.3.2 精细度实验 取葡萄糖对照品溶液0.7mL，置于25mL量瓶中，加蒸馏水至2mL，再参加1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂溶液，水浴5min，定容至刻度，摇匀。479nm波长下接连测定6次吸光度值，RSD值为0.5981%。标明仪器精细度杰出。
2.1.3.3 安稳性实验 取供试品溶液1mL，置于25mL量瓶中，加水至2mL，再参加1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂溶液，水浴5min，定容至刻度，摇匀。置于479nm波长下，别离于0、0.5、1.0、1.5、2h 测定吸光度。其RSD值为0.7197%，标明供试品溶液在2h内安稳。
2.1.3.4 重复性实验 取同一子实体样品5份，别离依照2.1.2项下办法制备供试品溶液，别离取1mL，置于25mL量瓶中，加蒸馏水至2mL，再参加1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂溶液，水浴5min，定容，摇匀。置于479nm波长下测定吸光度值。其RSD值为1.0752%，标明本办法重复性杰出。
2.1.3.5 加样回收率实验 称取已知总糖含量的子实体粉末6份，每份约1.25 g，精细称取，别离精细参加必定量的葡萄糖规范品，依照“2.1.2”项下制备办法制得续滤液，依法别离测总糖含量，核算加样回收率。实验数据见表1。成果标明，本办法葡萄糖加样回收率RSD为0.41%，阐明该办法测定裂褶菌子实体糖的含量安稳牢靠。
2.1.4 样品含量测定 按3，5-二硝基水杨酸定糖法对样品中总糖和还原糖进行测定，总糖减去还原糖即为多糖含量。核算出裂褶菌子实体中多糖的含量为7.26%。见表2。
2.2 蛋白质的含量测定[13-15]endprint
选用考马斯亮蓝法测定裂褶菌子实体中蛋白质的含量。
2.2.1 规范蛋白质溶液的制造 精细称定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，即得2mg/mL规范蛋白质溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精细称取子实体粉末5.0082g，加8倍量生理盐水浸渍24h，滤液透析浓缩，定容至10mL量瓶中，即得供试品溶液。
2.2.3 办法学调查
2.2.3.1 线性关系调查 精细参加规范蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于试管中，别离加生理盐水至0.2mL，再参加考马斯亮蓝试剂10mL，混匀，5min后于595nm波长下测定其吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白质在0.0078～0.0312mg/mL 范内呈杰出的线性关系。
2.2.3.2 精细度实验 取供试品溶液，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度，重复6次，其RSD值为0.5142%，标明仪器精细度杰出。
2.2.3.3 安稳性实验 取供试品溶液，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依照测定法每距离5min测定其在595nm波长下吸光度，测定20min内吸光度值的改变，其RSD值为0.5920%，标明样品溶液在20min内安稳。
2.2.3.4 重复性实验 取子实体粉末6份，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度值，其RSD值为1.0867%，标明该办法测定蛋白质含量重复性杰出。
2.2.3.5 加样回收率实验 取已知蛋白质含量的子实体粉末6份，每份约2.5g，精细称定，别离精细参加必定量的蛋白规范品，按供试品溶液制备办法得续滤液，依法测定吸光度，核算回收率，实验数据见表3。
2.2.3.6 样品含量测定 对供试品溶液进行测定，依照2.2.2项下操作，平行3份，测定其吸光度值。代入规范曲线核算样品蛋白质含量，子实体中总蛋白含量为0.26%，成果见表4。
3 评论
裂褶菌子实体中多糖浓度在0.0120～0.040mg/mL范围内具有杰出的线性关系，回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为7.26%；蛋白浓度在0.0078～0.0321mg/mL范围内具有杰出的线性关系，回归方程为y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为0.26%；本研讨树立的办法简洁、快速、精确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定供给了根据。多糖有进步免疫力等多种杰出的药理效果，所以具有杰出的研讨与开发远景，本实验为开发新式药物供给了理论根据。
[参考文献]
[1] 卯晓岚.我国大型真菌[M].郑州：河南科技技能出版社，2000：79.
[2] 陈慧芳.植物活性成分辞典（第一册）[M].北京：我国医药科技出版社，2000.
[3] 胡德群，胡鸣.裂褶菌多糖的研讨[J].四川中草药研讨，1994（36）：21-23.
[4] 朱泉娣.裂褶菌子实体无机元素剖析[J].中草药，1986，17（8）：17-18.
[5] 李梦杰，王翠玲，张玉金，等.裂褶菌液体和固体培育产漆酶的比较研讨[J].西南农业学报，2011，24（6）：2311-2315.
[6] 郭孟璧，田茂军，李聪，等.裂褶菌挥发油化学成分的研讨[J].云南化工，2006，33（3）：16-27.
[7] 毛绍春，李竹英，李聪.裂褶菌化学成分研讨[J].天然产品研讨与开发，2007，19（4）：610-613.
[8] 李兆兰.裂褶菌多糖的结构研讨[J].南京大学学报（天然科学版），1994，30（3）：482-487.
[9] 宋爱荣，王光远，赵晨，等.裂褶菌多糖体外抑瘤实验[R].全国药用真菌学术研讨会论文集，2008：224.
[10] 王凤仙，夏志俊，江月仙，等.不同来历的裂褶菌子实体及发酵培育的菌丝体中氨基酸与无机元素剖析[J].现代使用药学，1989，6（1）：18-20.
[11] 赵琪，袁理春，李荣春.裂褶菌研讨进展[J].食用菌学报，2004，11（1）：59-63.
[12] 王丽娜，陈水钫，张兵，等. 3，5一二硝基水杨酸法测定多糖含量的研讨进展[J].吉林医药学院学报，2009， 30（4）：232-234.
[13] 李娟，张推庭，曾伟，等.使用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].我国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.
[14] 徐杰伟，温少磊，蔡早育.考马斯亮蓝法测定微量蛋白的条件评论[J].江西医学查验，2003，21（5）：353-354.
[15] 宋景秋，王以立.双缩脲法与考马斯亮蓝法测定母乳总蛋白的使用比较[J].临床查验杂志，1997，15（2）：108.
（收稿日期：2014-09-11）endprint
选用考马斯亮蓝法测定裂褶菌子实体中蛋白质的含量。
2.2.1 规范蛋白质溶液的制造 精细称定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，即得2mg/mL规范蛋白质溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精细称取子实体粉末5.0082g，加8倍量生理盐水浸渍24h，滤液透析浓缩，定容至10mL量瓶中，即得供试品溶液。
2.2.3 办法学调查
2.2.3.1 线性关系调查 精细参加规范蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于试管中，别离加生理盐水至0.2mL，再参加考马斯亮蓝试剂10mL，混匀，5min后于595nm波长下测定其吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白质在0.0078～0.0312mg/mL 范内呈杰出的线性关系。
2.2.3.2 精细度实验 取供试品溶液，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度，重复6次，其RSD值为0.5142%，标明仪器精细度杰出。
2.2.3.3 安稳性实验 取供试品溶液，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依照测定法每距离5min测定其在595nm波长下吸光度，测定20min内吸光度值的改变，其RSD值为0.5920%，标明样品溶液在20min内安稳。
2.2.3.4 重复性实验 取子实体粉末6份，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度值，其RSD值为1.0867%，标明该办法测定蛋白质含量重复性杰出。
2.2.3.5 加样回收率实验 取已知蛋白质含量的子实体粉末6份，每份约2.5g，精细称定，别离精细参加必定量的蛋白规范品，按供试品溶液制备办法得续滤液，依法测定吸光度，核算回收率，实验数据见表3。
2.2.3.6 样品含量测定 对供试品溶液进行测定，依照2.2.2项下操作，平行3份，测定其吸光度值。代入规范曲线核算样品蛋白质含量，子实体中总蛋白含量为0.26%，成果见表4。
3 评论
裂褶菌子实体中多糖浓度在0.0120～0.040mg/mL范围内具有杰出的线性关系，回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为7.26%；蛋白浓度在0.0078～0.0321mg/mL范围内具有杰出的线性关系，回归方程为y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为0.26%；本研讨树立的办法简洁、快速、精确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定供给了根据。多糖有进步免疫力等多种杰出的药理效果，所以具有杰出的研讨与开发远景，本实验为开发新式药物供给了理论根据。
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[9] 宋爱荣，王光远，赵晨，等.裂褶菌多糖体外抑瘤实验[R].全国药用真菌学术研讨会论文集，2008：224.
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[11] 赵琪，袁理春，李荣春.裂褶菌研讨进展[J].食用菌学报，2004，11（1）：59-63.
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[13] 李娟，张推庭，曾伟，等.使用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].我国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.
[14] 徐杰伟，温少磊，蔡早育.考马斯亮蓝法测定微量蛋白的条件评论[J].江西医学查验，2003，21（5）：353-354.
[15] 宋景秋，王以立.双缩脲法与考马斯亮蓝法测定母乳总蛋白的使用比较[J].临床查验杂志，1997，15（2）：108.
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选用考马斯亮蓝法测定裂褶菌子实体中蛋白质的含量。
2.2.1 规范蛋白质溶液的制造 精细称定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，即得2mg/mL规范蛋白质溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精细称取子实体粉末5.0082g，加8倍量生理盐水浸渍24h，滤液透析浓缩，定容至10mL量瓶中，即得供试品溶液。
2.2.3 办法学调查
2.2.3.1 线性关系调查 精细参加规范蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于试管中，别离加生理盐水至0.2mL，再参加考马斯亮蓝试剂10mL，混匀，5min后于595nm波长下测定其吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白质在0.0078～0.0312mg/mL 范内呈杰出的线性关系。
2.2.3.2 精细度实验 取供试品溶液，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度，重复6次，其RSD值为0.5142%，标明仪器精细度杰出。
2.2.3.3 安稳性实验 取供试品溶液，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依照测定法每距离5min测定其在595nm波长下吸光度，测定20min内吸光度值的改变，其RSD值为0.5920%，标明样品溶液在20min内安稳。
2.2.3.4 重复性实验 取子实体粉末6份，依照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度值，其RSD值为1.0867%，标明该办法测定蛋白质含量重复性杰出。
2.2.3.5 加样回收率实验 取已知蛋白质含量的子实体粉末6份，每份约2.5g，精细称定，别离精细参加必定量的蛋白规范品，按供试品溶液制备办法得续滤液，依法测定吸光度，核算回收率，实验数据见表3。
2.2.3.6 样品含量测定 对供试品溶液进行测定，依照2.2.2项下操作，平行3份，测定其吸光度值。代入规范曲线核算样品蛋白质含量，子实体中总蛋白含量为0.26%，成果见表4。
3 评论
裂褶菌子实体中多糖浓度在0.0120～0.040mg/mL范围内具有杰出的线性关系，回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为7.26%；蛋白浓度在0.0078～0.0321mg/mL范围内具有杰出的线性关系，回归方程为y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为0.26%；本研讨树立的办法简洁、快速、精确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定供给了根据。多糖有进步免疫力等多种杰出的药理效果，所以具有杰出的研讨与开发远景，本实验为开发新式药物供给了理论根据。
[参考文献]
[1] 卯晓岚.我国大型真菌[M].郑州：河南科技技能出版社，2000：79.
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[7] 毛绍春，李竹英，李聪.裂褶菌化学成分研讨[J].天然产品研讨与开发，2007，19（4）：610-613.
[8] 李兆兰.裂褶菌多糖的结构研讨[J].南京大学学报（天然科学版），1994，30（3）：482-487.
[9] 宋爱荣，王光远，赵晨，等.裂褶菌多糖体外抑瘤实验[R].全国药用真菌学术研讨会论文集，2008：224.
[10] 王凤仙，夏志俊，江月仙，等.不同来历的裂褶菌子实体及发酵培育的菌丝体中氨基酸与无机元素剖析[J].现代使用药学，1989，6（1）：18-20.
[11] 赵琪，袁理春，李荣春.裂褶菌研讨进展[J].食用菌学报，2004，11（1）：59-63.
[12] 王丽娜，陈水钫，张兵，等. 3，5一二硝基水杨酸法测定多糖含量的研讨进展[J].吉林医药学院学报，2009， 30（4）：232-234.
[13] 李娟，张推庭，曾伟，等.使用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].我国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.
[14] 徐杰伟，温少磊，蔡早育.考马斯亮蓝法测定微量蛋白的条件评论[J].江西医学查验，2003，21（5）：353-354.
[15] 宋景秋，王以立.双缩脲法与考马斯亮蓝法测定母乳总蛋白的使用比较[J].临床查验杂志，1997，15（2）：108.
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