结核杆菌抗体弱阳性 环介导等温扩增法检测结核分枝杆菌的使用
杜伟勤 薛婷 王桂琴
[摘要]意图 树立环介导等温扩增技能（LAMP）检测肺结核患者痰液中的结核分枝杆菌（MTB）基因。办法 以结核分枝杆菌高度保存的16S rDNA为靶基因规划3对特异性引物，搜集2017年1～12月临床确诊的肺结核患者痰液89份，非肺结核患者痰液20份以及MTB规范菌株（H37RV），树立LAMP办法，并检测其特异性、灵敏性，以MTB培育成果为金规范，用SPSS13.0数据处理并进行统计学剖析。成果 成功树立LAMP检测痰液中MTB的办法，其特异性为100%，灵敏性为50 copies。在临床患者痰液检测中，特异性和灵敏性别离为85.00%、96.63%，与MTB培育成果比较差异无统计学含义（P>0.05）。定论 LAMP检测MTB特异性和灵敏度高，适用于底层医疗单位MTB的快速检测。
[关键词]环介导等温扩增；结核分枝杆菌；查验
[中图分类号] R939.121 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）5（c）-0123-04
Application of loop-mediated isothermal amplification for the detection of mycobacterium tuberculosis
DU Wei-qin1 XUE Ting2 WANG Gui-qin1▲
1.Education and Research Office of Microbiology and Immunology，Shanxi Medical University of Taiyuan City，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China；2.Department of Clinical Laboratory，People′s Hospital of Lvliang City，Shanxi Province，Lvliang 033000，China
[Abstract]Objective To establish the loop-mediated isothermal amplification technique （LAMP） for the detection of Mycobacterium tuberculosis （MTB） gene in the sputum of patients with pulmonary tuberculosis.Methods Three pairs of specific primers were designed based on highly conserved 16S rDNA of MTB as the target gene.From January 2017 to December 2017，89 sputum samples from the patients were with clinically diagnosed pulmonary tuberculosis，20 sputum samples from non-tuberculosis patients and the MTB standard strain （H37RV） were collected.LAMP method was established，and its specificity and sensitivity were tested.The MTB culture results were taken as the gold standard.SPSS13.0 was used for data processing and statistical analysis.Results LAMP was successfully established for the detection of MTB in the sputum.Its specificity was 100% and its sensitivity was 50 copies.In the clinical sputum testing，the specificity and sensitivity were 85% and 96.63% respectively.The results were almost identical with those of the MTB culture，the difference was statistically significant （P>0.05）.Conclusion LAMP has high specificity and high sensitivity in the detection of MTB，which is suitable for the rapid detection of MTB in primary medical institutions.
[Key words]Loop-mediated isothermal amplification；Mycobacterium tuberculosis；Test
結核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是一种成长缓慢、经过飞沫经呼吸道传达引起人类结核病的病原菌。世界卫生组织（WHO）2017年的陈述[1]指出，结核病仍然是全球头号流行症，尽管近年来抗结核开展明显，但局势仍然严峻。2016年我国新增结核患者89.5万，陈述病例78.3万例。依据《中华医学会.结核病分册》对结核病确诊的规则，其确诊办法包含病原学、免疫学、放射学、组织学、分子生物学确诊等，其间病原学确诊是结核病的确诊金规范。但MTB痰涂片检出率低，培育周期长，不利于前期确诊和防备医治。WHO引荐的PCR法或快速液体培育法需求贵重设备和严厉的试验室条件，广阔底层结核病试验室条件尚不能满意此类办法的展开。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）为一种新式的核酸等温扩增办法。这种办法是经过BstDNA链置换聚合酶对意图基因的6个不同区域规划的3对引物（内引物、外引物、环引物）在60～65℃恒温条件下1 h内进行109～1010倍扩增[2-3]。因为其特异性强，扩增功率高，不需求贵重设备等多方面的优势备受人们的重视。本研讨运用LAMP检测办法对临床样本中的MTB 16S rDNA进行扩增，为其在底层医疗机构中运用奠定理论根底。
1资料与办法
1.1资料
1.1.1菌株来历 本试验运用的标本均来历于吕梁市人民医院查验科2017年1～12月搜集的标本共89例。供给标本的患者均经痰涂片和胸片查看确诊为结核病。别的搜集医院非结核患者标本的痰液20份，作为阴性对照。本研讨经医院医学道德委员会同意，一切患者均签定《知情同意书》。MTB规范菌株H37RV由吕梁市疾控中心惠赠。
1.1.2首要试剂与仪器 罗琴培育基（珠海贝索生物科技有限公司），甜菜碱（Sigma公司），Bst大片段DNA聚合酶（NEB公司），DNA Marker， dNTP （大连宝生物工程有限公司），SYBR GreenⅠ（Thermo fisher公司），结核分枝杆菌核酸试剂盒（中山大学迪安基因有限公司），恒温水浴箱（上海精细仪器仪表有限公司），UVP凝胶成像系统（美国BioSpectrum公司）。
1.2办法
1.2.1细菌培育及DNA模板的制备 将痰液分为两份。一份接种于罗琴培育基上；另一份用4%的NaOH污染。依照MTB核酸检测试剂盒阐明书提取DNA。
1.2.2 LAMP试验引物 本研讨中所用引物是针对MTB 16S rDNA规划3对引物，引物序列参阅Pandey等[4]报导。
1.2.3 LAMP反响系统与反响条件 25 μlLAMP 系统包含：外引物（F3和B3）各 0.2 μmol/L，内引物（FIP和BIP）各 1.6 μmol/L，甜菜碱1.6 mol/L，6 mmol/L Mg2SO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA 聚合酶 1 μl、2.5×的buffer，2 μl 模板 DNA。将反响管置于62℃恒温水浴箱内反响 1 h后，于80℃ 10 min停止反响。
1.2.4 LAMP检测的特异度 以MTB H37RV为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照，以从临床非结核病患者中别离的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、鲍曼不动杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌的DNA为模板进行扩增。别离取5 μl扩增产品，于2%琼脂糖凝胶中电泳后，UVP摄影，呈现LAMP 特征性梯状条带为阳性成果，无梯状条带为阴性成果。
1.2.5 LAMP反响的灵敏度 NanoDrop超微量紫外分光光度计对H37RV的DNA定量测定，双蒸水调整浓度至1×108/ul，倍比稀释，以稀释后梯度DNA为模板，进行LAMP扩增，琼脂糖凝胶电泳验证。
1.2.6 LAMP的临床点评 对临床搜集的89 例MTB患者的痰液DNA和20例非結核病患者的痰液DNA进行LAMP 扩增，将LAMP扩增成果与罗琴培育基培育成果进行一致性比较。一致性点评：Kappa值0.00～0.40为一致性较差，0.41～0.60为一致性一般，0.61～0.80为一致性较高，0.81～1.00为简直完全一致。
2成果
2.1 LAMP的特异性
用LAMP检测MTB H37RV与其他非结核病肺炎患者的痰液成果如图1所示，能够看出，只要H37RV有梯度条带呈现，其他菌株未呈现梯度条带。综上此办法在MTB 检测中具有高度特异性。
2.2 LAMP的灵敏度
将提取的MTB规范菌株的DNA进行倍比稀释，用LAMP进行扩增，成果如图2所示。 从图可知，电泳后的产品呈阶梯状条带，在第8泳道仍可闪现，阐明LAMP的检测限为50 copies。
2.3 LAMP检测临床标本的部分成果
LAMP检测临床结核阳性标本的部分成果（图3），其间7号和10号未呈现扩增条带。可视性检测成果（图4）所示：反响管内液体绿色为阳性，橙色为阴性。
2.4 LAMP的临床点评
对临床搜集的89 例 MTB患者的痰液DNA和20例非结核病患者的痰液 DNA进行LAMP 扩增，将LAMP扩增成果与罗琴培育基培育成果进行一致性比较，所得试验成果如表2所示，特异性和灵敏性别离为85.00%、96.63%，对这两种办法经一致性查验后比较，差异无统计学含义（P>0.05），由 Kappa值=0.82可知，两种办法的一致性杰出。
3评论
LAMP技能自2000年日本人创造以来，己经在许多范畴得到了很好的开展，如大肠杆菌[5]、沙门菌[6]、金黄色葡萄球菌[7]、螺旋体[8]、支原体[9]、病毒[10-11]等病原生物体的检测文献相继被报导。据国内学者胡宗悦报导[12]，在PubMed上宣布的关于LAMP的文献约有1622篇，在CNKI上约为4220篇，能够看出LAMP检测技能已成为一种东西，广泛运用于医疗、动植物、根底、食物水产和环境等方面。与其他技能比较，LAMP检测技能具有以下优势：①LAMP检测技能不像PCR需求变性、退火和延伸等过程对温度的准确操控，只用一台恒温水浴箱即可完结试验，所用设备廉价、操作简略；②LAMP检测技能针对靶基因规划 4 条引物，再添加2条外引物，可使得其扩增时刻缩短到1 h内，极大地提高了扩增功率；③在LAMP 扩增过程中发作很多的焦磷酸根离子，可与SYBR GreenⅠ发作显色反响[13]，可经过调查反响系统色彩改变来快速判别产品的生成。