脊髓损害的临床表现 脊髓损害后外周安排炎症反应在并发2型糖尿病中的效果研讨

朱根应　　程瑞动　　周亮　　李厥宝　　叶祥明

[摘要] 意图 通過调查SD大鼠脊髓危害后血糖的改变及其外周安排炎症反响状况，讨论脊髓危害并发2型糖尿病的或许机制。 办法 将24只SD大鼠随机分为两组：假模组和脊髓危害组，其间假模组又分为假模一般饲料组（Sham+LFD）和假模三高饲料组（Sham+HFD）两个亚组，脊髓危害组分为脊髓危害一般饲料组（SCI+LFD）和脊髓危害三高饲料组（SCI+HFD）两个亚组。以改进的Allens碰击法制造脊髓危害动物模型，在试验开端前及8周时监测各组体重、血糖、葡萄糖耐量试验目标。于8周时取大鼠肝脏、脾脏及内脏脂肪安排，运用实时荧光定量PCR办法调查各安排胰岛素、TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10等炎症因子的表达状况。 成果 各组大鼠体重均有显着添加。脊髓危害后大鼠血糖较危害前显着升高，外周安排 TNF-α、IL-1β、IL-6表达较假模组显着升高，IL-10则较假模组显着下降。比较Sham+LFD组，Sham+HFD组、SCI+LFD组以及SCI+HFD组大鼠安排中胰岛素、TNF-α、IL-1β含量显着添加，IL-10显着削减；比较Sham+HFD组，SCI+HFD组大鼠安排中胰岛素、TNF-α、IL-1β含量进一步添加，IL-10则进一步削减。 定论 脊髓危害后外周炎症反响在脊髓危害后并发2型糖尿病中有重要效果。

[关键词] SD大鼠；脊髓危害；2型糖尿病；炎症反响

[中图分类号] R589 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）27-0038-04

Study on the effect of inflammatory reactions of peripheral tissues after spinal cord injury on concurrent type 2 diabetes mellitus

ZHU Genying CHENG Ruidong ZHOU Liang LI Juebao YE Xiangming

Department of Rehabilitative Medicine， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， the Peoples Hospital Affiliated to Hangzhou Medical College， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the possible mechanism of spinal cord injury complicated with type 2 diabetes mellitus by observing the changes of blood glucose and the inflammatory response of peripheral tissue in SD rats after spinal cord injury. Methods A total of 24 SD rats were randomly divided into two groups： sham model group and spinal cord injury group. The sham model group was further divided into two subgroups： Sham+LFD group and Sham+HFD group. Spinal cord injury group was further divided into two groups： SCI+LFD group and SCI+HFD group. The animal model for spinal cord injury was made by modified Allen's impact method. Body weight， blood glucose and glucose tolerance indices were measured before experiment and 8 weeks after the experiment. At 8 weeks， the rat liver， spleen and visceral adipose tissues were collected. The expression of insulin and inflammatory factors such as TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-10 were observed by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The body weight in each group was increased significantly. Blood glucose in rats after spinal cord injury was significantly higher than that before injury. The expression of TNF-α， IL-1β and IL-6 in peripheral tissues was significantly higher than that in the sham model group， and IL-10 was significantly lower than that in the sham model group. Compared with the Sham+LFD group， the levels of insulin， TNF-α and IL-1β in Sham+HFD group， SCI+LFD group， and SCI+HFD group were significantly increased， and IL-10 was significantly decreased. Compared with Sham+HFD group， the levels of insulin， TNF-α and IL-1β in SCI+HFD group were increased further， and IL-10 was further decreased. Conclusion Peripheral inflammatory response after spinal cord injury plays an important role in the treatment of concurrrent type 2 diabetes mellitus after spinal cord injury.endprint

[Key words] SD rats； Spinal cord injury； Type 2 diabetes mellitus； Inflammatory response

临床中脊髓危害患者胰岛素反抗、糖耐量反常发作率显着增高，近年有研讨标明[1，2]，脊髓危害与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发作几率显着添加相关，而在进一步校对其他相关风险要素后，该相关性依然存在，标明脊髓危害是2型糖尿病发作的独立风险要素。2型糖尿病系外周细胞对胰岛素灵敏性下降，血糖升高，体内胰岛素代偿性添加，导致糖代谢紊乱[3，4]。研讨证明机体的缓慢炎症状况是导致脂肪、肌肉及肝脏等胰岛素反抗的主要原因[5]，外周缓慢炎症在2型糖尿病发作开展中起重要效果[6]。脊髓危害后机体相对会发作反常应激反應导致免疫系统紊乱，过度活化的免疫细胞排泄多种炎性介质，IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子经过搅扰胰岛素信号传递，在胰岛素反抗的发作中发挥重要效果[7，8]。临床证明，给予糖尿病患者胰岛素增敏剂医治，可显着改进其缓慢炎症水平，提示胰岛素反抗与缓慢炎症严密相关[9]。脊髓危害后脑与脊髓之间的生理性联络和解剖连续性被损坏，反响机制中止或受损，使脊髓危害后外周长时刻处于反常应激状况，但相关研讨现在尚无清晰报导。本研讨拟经过调查SD大鼠脊髓危害后外周安排炎症反响状况及其对胰岛素灵敏性的影响，讨论脊髓危害并发2型糖尿病的或许机制，现报导如下。

1 材料与办法

1.1 试验动物

动物及分组：选取24只健康SD大鼠（8周龄，雄性大鼠，体重150～180 g，一般级）为研讨目标，经适应性养殖3 d后随机分为假模对照组：假模一般饲料组（Sham+LFD）、假模三高饲料组（Sham+HFD），脊髓危害组：脊髓危害一般饲料组（SCI+LFD）、脊髓危害三高饲料组（SCI+HFD），每组6只。一般饲料组进食国家标准固体混合饲料，三高饲料组进食配方三高饲料，诱发胰岛素反抗及糖尿病，每日自在饮水。各组在试验前（0周）及试验8周后进行体重丈量。脊髓危害组行改进Allens法形成脊髓不完全性危害，具体办法如下所述，假模组行相同手术操作但不进行脊髓冲击危害。

1.2 模型制备

选用改进的Allens碰击法制造SCI动物模型[10]。试验动物经5%水合氯醛（300 mg/kg体重）腹腔打针麻醉后，背部剃毛，惯例消毒，定位棘突后以T10为中心作长约3 cm皮肤切断，钝性剥离脊旁肌肉露出脊椎后，微型咬骨钳咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，露出脊髓，以上操作进程中特别留意使硬脊膜完好。运用MASCIS Impactor（W.M. Keck Center of Rutgers University，USA）准确碰击（10 g，11.5 cm），制造脊髓不完全危害模型，模型成功标志：可见大鼠尾巴痉挛性摇摆，双下肢躯体回缩样扑动，脊髓冲击部位淤血，双下肢缓和性瘫痪。假模组相同进行上述操作，咬除椎板并露出脊髓，但不进行重物碰击。一切试验大鼠术毕均逐层缝合切断，并消毒外表。术后留意保温，单笼养殖，细心护理。

1.3 血糖目标监测

各组动物禁食8 h，尾部取血，选用便携式血糖检测仪（美国强生公司）检测空腹血糖，再以2 g/kg体重腹腔打针葡萄糖，别离于打针后15、30、45、120、180 min尾部采血，测定血糖浓度。在8周后重复进行上述检测。

1.4 标本选材

试验8周时，在禁食8 h后，断头处死敏捷取脑，赶快别离出下丘脑后浸入液氮中急冻，同时取肝脏、脾脏、睾周脂肪（内脏脂肪），分装做好符号后置于-80℃的超低温冰箱中保存，用于免疫荧光检测。

1.5 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR测定所取各组大鼠肝脏、脾脏、睾周脂肪安排胰岛素、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-6表达：取安排破坏（脂肪安排按5 mL/1 g份额于含1 mg/mL胶原酶的缓冲液中消化45 min），参加裂解液匀浆，低温离心，抽提总蛋白在SDS2聚丙烯酰胺凝胶上电泳，30 mA恒流条件下，4℃过夜，将蛋白电转移到硝酸纤维素膜，关闭后，参加一抗（美国Abcam公司）后4℃孵育过夜。TBST洗膜后加二抗羊抗IgG（北京中山生物技术有限公司），常温孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化学发光试剂（美国Pierce公司）检测阳性信号，选用ScionImage软件核算条带的相对光密度值。试验重复3次。相对光密度值=试验组或对照组光密度值/β-actin光密度值。

1.6 统计学办法

所得数据选用SPSS19.0统计学软件进行统计分析，计量材料以（x±s）标明，组内不同时刻比较选用配对样本t查验，多组间比较选用单要素方差分析Oneway Annova，P<0.05为差异有统计学含义。

2 成果

2.1 各组大鼠体重改变

干涉前（0周）及干涉8周后在同等条件下进行体重丈量，Sham+LFD组及Sham+HFD组大鼠体重较干涉前均有显着添加，三高饲料组添加起伏更高；相似的状况在脊髓危害组大鼠中相同能够看到，标明三高饲料及脊髓危害对体重的添加均有显着影响。见表1。

2.2 各组大鼠血糖目标比较

Sham+HFD组、SCI+LFD组及SCI+HFD组8周时的血糖水平较0周时均显着添加，成果有统计学差异，Sham+LFD组8周时的血糖水平与0周比较，无统计学差异。估测三高饲料及脊髓危害后均易呈现血糖增高。见表2。

2.3各组大鼠安排中胰岛素及IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6的含量比较

比较Sham+LFD组，LFD饲料养殖的SCI+LFD组、HFD饲料养殖的Sham+HFD组以及SCI+HFD组大鼠安排中胰岛素、TNF-α、IL-1β含量显着添加，IL-10显着削减；比较Sham+HFD组，HFD饲料养殖的SCI+HFD组大鼠安排中胰岛素、TNF-α、IL-1β含量亦有显着添加，IL-10则显着削减，成果均有统计学差异。以上成果标明，HFD养殖条件下，脊髓危害对大鼠安排中胰岛素、IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6含量有着重要的影响。大鼠安排中胰岛素、IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6含量的ELISA检测成果见表3。endprint

3 討论

脊髓危害（spinal cord injury，SCI）是由各种原因引起的脊髓结构、功用的危害，形成危害水平以下不同程度的运动、感觉和自主神经功用障碍。脊髓危害的医治与恢复是现代医学界的一大难题，脊髓危害后并发症的多发性也严重影响着患者的日子质量，其对代谢的影响近年来也越来越引起注重[1]。许多研讨标明，脊髓危害与2型糖尿病之间存在着亲近的联系[1，2]。有文献报导脊髓危害后发作2型糖尿病的几率从10%～22%不等[11-13]。

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）系外周细胞对胰岛素灵敏性下降，血糖升高，体内胰岛素代偿性添加，导致糖代谢紊乱。以往研讨一般以为脊髓危害患者血糖浓度常升高是应激反响所引起[14]，临床上证明，给予糖尿病患者胰岛素增敏剂医治，可显着改进患者的缓慢炎症水平，提示胰岛素反抗与缓慢炎症严密相关。近年研讨标明，胰岛素反抗与缓慢炎症交互效果，促进2型糖尿病的发作开展[15]。缓慢炎症导致胰岛素反抗的机制主要是多种促炎细胞因子经过影响炎症信号通路搅扰胰岛素的信号传递进程所形成的，胰岛素反抗又可加剧缓慢炎症。在2型糖尿病时脂肪细胞会排泄一系列的炎症因子，包含TNF-α、IL-1β、IL-6等，会导致巨噬细胞向脂肪安排搬迁、滋润，发作更多的炎症因子，而炎症因子会导致胰岛素灵敏细胞内胰岛素信号转导受阻，然后形成胰岛素反抗[16，17]。肝脏的胰岛素反抗表现为血胰岛素水平的升高，升高的胰岛素不能有用地按捺肝糖的异生和餐后糖原的贮存削减，导致空腹和餐后血糖水平的升高。

以往研讨多集中于糖尿病风险要素与胰岛素反抗之间的联系[18]，以及β细胞上胰岛素信号通路的缺点与β细胞凋亡的添加和糖尿病发作之间的联系[19，20]。近年来，氧化应激在糖尿病发作和开展中的效果逐步引起人们的注重。有研讨发现，长时刻的血糖操控欠安导致机体氧化应激危害是糖尿病并发症的一起机制，而氧化应激状况可促进炎症反响，炎症反响反过来又可加剧氧化应激状况，因而，改进氧化应激状况并按捺炎性因子可有用防治糖尿病并发症[21]。

本研讨经过对脊髓危害大鼠的炎性因子的检测，并与假模组进行比较，标明脊髓危害后大鼠无论是正常饮食组仍是高脂饮食组，其外周安排中胰岛素、TNF-α、IL-1β及IL-6含量均较假模组显着添加，而IL-10则显着下降。并且高脂饮食组的改变较正常饮食组改变更为显着。提示脊髓危害后大鼠体内会发作显着的外周炎性反响，生成更多的炎症因子，这些炎症因子或许会导致细胞内胰岛素信号转导受阻，然后形成胰岛素反抗，更进一步则会开展为2型糖尿病，部分提醒了脊髓危害后2型糖尿病发作几率上升的或许机制。这就为临床上脊髓危害后并发糖尿病进行干涉供给了思路，即怎么减轻机体的外周炎性反响，削减生成炎症因子，然后下降脊髓危害后发作2型糖尿病的几率。

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（收稿日期：2017-07-11）endprint