低氧血症sp02确诊规范 PI3K—Akt—eNOS信号通路在间歇性低氧减轻大鼠心肌缺血/再灌注损害中的效果

王媛媛　　曹建　　万建华

[摘要] 意图 探討空隙性低氧环境下，磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶信号通路（PI3K-Akt-eNOS）在大鼠心肌缺血/再灌注损害中的效果机制。 办法 64只大鼠随机分为4组，假手术组（n=16）、缺血/再灌注组（n=16）、缺血/再灌注组-间歇性低氧组（n=16）、间歇性低氧-缺血/再灌注-磷脂酰肌醇3-激酶按捺剂组（n=16）。选用球囊结扎冠状动脉办法制造心肌缺血再灌注动物模型，将老鼠暴露在低氧循环制造空隙性低氧动物模型，试验处理完毕后，经过TUNEL 法检测心肌细胞凋亡指数，Western-Blot办法检测磷酸化AKT蛋白（p-Akt）、磷酸化eNOS（p-eNOS）蛋白表达。 成果 与缺血/再灌注组比较，间歇性低氧+缺血/再灌注组心肌细胞凋亡指数为（21.73±4.56）%，心肌细胞凋亡指数削减，磷酸化AKt蛋白及磷酸化eNOS蛋白别离为（1.228±0.269）、（1.427±0.375），表达均升高，各组差异均有计算学含义（P<0.05）；与间歇性低氧+缺血/再灌注组比较，间歇性低氧-缺血/再灌注组大鼠+磷脂酰肌醇3-激酶按捺剂组大鼠心肌为（30.84±3.65），凋亡指数升高，磷酸化AKt蛋白及磷酸化eNOS蛋白别离为（0.624±0.146）、（0.842±0.246），表达均下降，各组差异均有计算学含义（P<0.05）。 定论 在间歇性低氧状态下，PI3K-Akt-eNOS信号通路能够削减心肌细胞凋亡，在心肌缺血/再灌注损害中具有维护机制。

[关键词] 磷酯酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶；间歇性低氧；心肌缺血/再灌注

[中图分类号] R541 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）27-0035-03

Effect of PI3K-Akt-eNOS signaling pathway on reducing myocardial ischemia-reperfusion injury after intermittent hypoxia in rats

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 WAN Jianhua3

1.Department of Cardiology， Nanchang Third Hospital， Nanchang 330009， China； 2.Department of Anesthesiology， Nanchang University Second Affiliated Hospital， Nanchang 330001， China； 3.Department of Anesthesiology， Jingdezhen Hospital of TCM in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase （PI3K-Akt-eNOS） signaling pathway on reducing myocardial ischemia-reperfusion injury after intermittent hypoxia in rats. Methods 64 rats were randomly divided into 4 groups： sham operation group（n=16）， ischemia-reperfusion group（n=16）， ischemia-reperfusion-intermittent hypoxia group（n=16）， intermittent hypoxia-ischemia-reperfusion-phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor group（n=16）. The animal model of myocardial ischemia and reperfusion was established by balloon ligation of coronary artery. The rats were exposed to hypoxic circulation to produce intermittent hypoxic animal models. After the end of the experiment， the apoptotic index of myocardial cells was detected by TUNEL method， and the expression of phosphorylated Akt protein （p-Akt） and phosphorylated eNOS （p-eNOS） protein was detected by Western-Blot method. Results Compared with ischemia-reperfusion group， the apoptotic index of myocardial cells was（21.73±4.56）% in intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group. The myocardial cell apoptosis index was decreased， and phosphorylated Akt protein and phosphorylated eNOS protein were（1.228±0.269）， （1.427±0.375） respectively. The expressions were all increased， and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）； compared with intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group， the myocardium of rats was（30.84±3.65）% in intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group+phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor group. The apoptosis index was increased， and the phosphorylated AKt protein and phosphorylated eNOS protein were（0.624±0.146）， （0.842±0.246） respectively. The expressions were all decreased and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Under the status of intermittent hypoxia， PI3K-Akt-eNOS signaling pathway can reduce myocardial ischemia-reperfusion injury by reducing the apoptosis of myocardial cells.endprint

[Key words] Phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase （PI3K-Akt-eNOS）； Intermittent hypoxia； Myocardial ischemia-reperfusion

缺血的心肌再灌注时会起一系列心脏及其血管的恶性事情，例如严峻的再灌注心律失常、安排水平无复流及心肌舒缩功用障碍等不良事情。对急性心肌梗死预后有直接影响的就是心肌缺血/再灌注损害。缺血/再灌注损害发作或许与炎性反应、细胞凋亡、氧失常、钙失常、pH 失常等原因有密切关系[1-3]，寻求再灌注医治时维护心肌的新靶点至关重要。现在研讨标明，间歇性低氧对心肌缺血/再灌注损害有维护效果，能够经过添加心脏对缺血、缺氧的耐受性来到达心脏维护的意图，在抗心肌缺血/再灌注损害中发挥重要效果。本试验拟评论在间歇性低氧状态下，磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）信号通路在大鼠心肌缺血/再灌注损害中的影响。

1 材料与办法

1.1 动物及试剂

本试验已经过南昌大学医学院动物道德委员会检查，许可证号[SCXK（赣）2009-0001]。选取8～10周健康清洁级SD大鼠64只，男女参半，体重（200±20）g，由南昌大学动物试验中心供给。磷酯酰肌醇-3激酶按捺剂（Wortmannin）渥曼青霉素购自天津药业焦作有限公司，Tunel 凋亡试剂检测盒购自德国Roche公司；小鼠p-eNOSp-Akt单克隆抗体、p-Akt抗体购自美国Santa Cruz公司；蛋白浓度测定规范品购自普利莱公司；兔抗小鼠辣根过氧化物酶符号的二抗购自美国Sigma公司。

1.2 试验分组及模型树立

64只试验动物随机分为4组，制造大鼠缺血/再灌注损害模型，试验前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，经过气管插管、人工呼吸，然后开胸结扎冠脉左前降支，收紧结扎线，30 min 后轻拉松结线，扩开血管，缝合[4]。经过低氧循环制造大鼠间歇性低氧模型：每日4次在低氧氧舱别离承受减压低氧处理，每次承受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再行氧和处理，循环5次，在低氧氧舱进行间歇性低氧处理14 d，对照组选取含氧量正常的老鼠。假手术组（n=16），选取尾静脉打针生理盐水，丝线穿过冠状动脉左室支，不结扎；缺血/再灌注组（对照组，I/R）（n=16），制造大鼠缺血/再灌注模型。间歇性低氧+缺血/再灌注组（n=16，IH+I/R）：树立间歇性低氧动物模型后，制造缺血/再灌注损害模型；间歇性低氧+缺血/再灌注+PI3K按捺剂组（n=16，IH+I/R+PI3K按捺剂），树立间歇性低氧模型，制造缺血/再灌注模型时，在冠状动脉左前降支阻塞15 min前打针磷脂酰肌醇酯3激酶按捺剂（渥曼青霉素）（24 μg/kg，ip）。

1.3 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡

根据试剂盒说明书操作，检测各试验组心肌细胞凋亡指数。运用符号液做阴性对照，阳性对照选取脱氧核糖核酸酶处理切片。随机在每张切片上选取10 个视界，计数凋亡细胞个数。心肌细胞凋亡指数=凋亡细胞个数/一切细胞个数的百分比。

1.4 经过Western blot法检测p-eNOS、p-Akt蛋白表达

动物模型制备完毕后，处死存活大鼠。选取各组缺血区左心室全层心肌安排约20 mg，添加蛋白裂解液，随后按过程匀浆、裂解、提取总蛋白。各组提取蛋白样品，先经过SDS-PAGE电泳转膜，室温下5%关闭2 h，再与稀释的Actin抗体、p-Akt、p-eNOS在4℃孵育过夜（稀释份额为1∶1000）。洗膜后孵育2 h（稀释份额为1∶3000）；再次洗膜，经过电化学发光显色曝光、摄影。以Actin作为内对照，经过BIORAD 软件剖析蛋白条带。

1.5 计算学剖析

选用SPSS 20.0计算软件处理数据，计量材料以均数±规范差（x±s）表明，各组间比较选用单因素方差剖析，P<0.05为差异具有计算学含义。

2 成果

2.1 各试验組心肌细胞凋亡指数

TUNEL 试剂盒检测心肌细胞凋亡指数，与假手术组比较，缺血/再灌注组可见较多TUNEL阳性凋亡细胞，凋亡指数显着升高（38.46±0.82）%；间歇性低氧处理后，心肌凋亡细胞显着削减、心肌细胞凋亡指数下降（21.73±4.56）%；间歇性低氧+缺血/再灌注组+ PI3K按捺剂（渥曼青霉素）组处理后，凋亡指数添加（29.84±3.65）%，各试验组比较，差异有计算学含义（P<0.05）。见表1及表2。

2.2心肌安排p-Akt、p-eNOS蛋白水平表达

Western blot 法检测各试验组Akt、p-eNOS蛋白表达，与假手术组比较，p-Akt、p-eNOS表达升高（P<0.05）；与IH+I/R组比较，IH+I/R+PI3K按捺剂组p-Akt、p-eNOS蛋白表达下降（P<0.05）。见表1、表2及封三图4。

3 评论

现在缺血性心脏病的发病率坐落原发性心脏病之首，其间心肌缺血再灌注损害约占50%，是冠状动脉内溶栓、冠脉搭桥以及介入医治中常见的严峻并发症[4-6]，怎么削减心肌缺血/再灌注损害已成为心肌维护的研讨树立热门之一。低氧是心肌缺血的主要因素，根底和临床医学研讨所重视的热门是怎么经过添加心脏对低/缺氧及对缺血耐受性而到达维护心脏的意图。研讨以为经过长时间（如缓慢低氧习惯）或短期缺血预习惯能够对心脏缺血呈现维护效果[7]。可是关于相关信号通路、受体途径以及信号转导等深层次的效果机制研讨较少。

苏氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸（PI3K-Akt）能够按捺细胞凋亡，参加细胞增殖分解，是细胞生计的一种重要信号通路之一，在心肌缺血再灌注损害机制中发挥重要效果。PI3K活化底物PI-3，4，5- P3（PIP3）与Akt结合，Akt被磷酸化而激活生成P-Akt，磷酸化的Akt具有抗凋亡、促细胞生计及促蛋白组成及等活性[8-10]。eNOS是组成NO的限速酶，含1203个氨基酸，其分子量为133 kDa，是由坐落人类 7号染色体7q35～7q36的NOS3基因编码的蛋白，是p-Akt下流的重要底物之一，可激活蛋白激酶及线粒体ATP敏感性钾离子通道，经过按捺线粒体通透性转化孔的敞开，下降线粒体膜通透性。还经过按捺钙超载，一起按捺线粒体开释下流Caspase-9等凋亡因子的表达，改进线粒体功用，并促进Bcl-2等抗凋亡因子的表达，削减细胞凋亡[11-13]。一起eNOS是Akt下流的重要底物之一，有研讨者以为Akt磷酸化位点激活，是一氧化氮的重要来历，一氧化氮在血管舒张、血管重构及生成及伤口愈合等方面发挥效果。在缺氧情况下，NO可经过磷脂酰肌醇3激酶或丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK） 信号通路诱导HIF-1发生，促进重生血管，搅扰代谢性习惯反应以从头习惯缺血的生理环境[14]。还发现eNOS源性的一氧化氮能够减轻血小板和白细胞和血小板在细胞壁的粘附，削减细胞凋亡[15]。eNOS的高表达可参加血流的调理，削减炎性细胞的滋润及按捺血管痉挛、避免细胞内钙超载等再灌注损害。endprint

本實验树立了缺血/再灌注损害及间歇性低氧模型，试验发现经过间歇性低氧预处理，PI3K-Akt信号途径激活，心肌细胞凋亡下降，p-Akt及eNOS蛋白表达添加。在运用PI3K按捺剂后，心肌细胞凋亡指数添加，-Akt及eNOS蛋白表达下降。试验成果提示间歇性低氧处理后，激活PI3K-Akt信号途径被激活，p-AKt表达添加，与此一起下流底物eNOS蛋白表达添加，减轻心肌细胞凋亡，这一效应可被PI3K特异性按捺剂渥曼青霉素拮抗，提示在间歇性低氧状态下，经过激活PI3K/Akt信号通路，激活P-Akt及活化内皮型一氧化氮合酶，这些下流底物或许经过提高抗凋亡蛋白表达，按捺促凋亡蛋白等机制下降心肌细胞凋亡率，从而在缺血/再灌注损害中起到维护效果。

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（收稿日期：2017-06-15）endprint