氧化应激巨噬细胞模型 L02脂肪变模型中氧化应激的发作及羊栖菜多糖的干涉效果
吴利敏+夏盛隆+申苏建+夏宣平+薛战雄+蒋益
[摘要] 意图 树立人正常肝细胞株（L02）脂肪变模型，评论软脂酸（PA）对肝细胞氧化应激的效果及羊栖菜多糖（SFPS）对脂肪变肝细胞氧化复原体系的影响。 办法 选用0.5 mmol/L的PA诱导L02细胞树立脂肪变模型，并予以不同浓度（25、50、100 μg/mL）SFPS进行干涉。Annexin V-FITC标记法检测细胞的凋亡，MTT比色法检测细胞增殖生机，测定细胞内过氧化产品丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）。 成果 SFPS可按捺PA对L02细胞增殖活性的下降和凋亡率的上升，下降MDA含量，升高SOD水平，不同浓度组间比较差异有统计学含义且具有剂量依靠性。 定论 L02细胞脂肪变性时发作显着的氧化应激，羊栖菜多糖能在必定程度上减轻氧化危害、抗细胞凋亡。
[关键词] 羊栖菜多糖；氧化应激；脂肪肝；软脂酸
[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0017-03
The occurrence of oxidative stress in L02 fatty model and the intervention of sargassum fusiforme polysaccharide
WU Limin XIA Shenglong SHEN Sujian XIA Xuanping XUE Zhanxiong JIANG Yi
Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China
[Abstract] Objective To establish a model of fatty degeneration in human normal liver cell line（L02） and to investigate the effect of palmitate（PA） on oxidative stress in hepatocytes and the effect of SFPS on the redox system of fatty liver cells. Methods L02 cells were induced by 0.5 mmol/L PA to establish a model of fatty degeneration， and were treated with different concentrations of SFPS（25， 50， 100 μg/mL）. Cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC labeling method. Cell proliferation activity was measured by MTT colorimetric assay. Intracellular peroxide products including malondialdehyde（MDA） and superoxide dismutase（SOD） were measured. Results SFPS could inhibit the decrease of proliferation activity and apoptosis rate of L02 cells， decrease the content of MDA and increase the level of SOD， and the difference was statistically significant among different concentration groups and dose-dependent. Conclusions The oxidative stress occurs in the fatty degeneration of L02 cells. Sargassum fusiforme polysaccharide can alleviate oxidative damage and resist apoptosis to a certain extent.
[Key words] Sargassum fusiforme polysaccharide； Oxidative stress； Fatty liver； Palmitic acid非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發病机制及病理根底尚不彻底清晰，其间“二次冲击”[1]被认为是现在最为老练的解说发病机制的学说。氧化应激关于NAFLD的发作开展起着关键效果[2，3]。近几年，有报导称羊栖菜多糖（sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）经证明有抗凋亡[4]、抗氧化[5，6]、抗肿瘤[7，8]、抗肝纤维化[9，10]等多种生物活性。本研讨首要调查羊栖菜多糖在软脂酸（palmitic acid，PA）所构成的肝细胞脂肪变模型中的干涉效果，然后为中药防治NAFLD供给理论及试验根据。
1 材料与办法
1.1 试验细胞
正常人肝细胞株L02。
1.2 试验材料
羊栖菜多糖（SFPS）由温州医科大学试验室制备。Dispase购自日本Sanko公司，MTT粉购自美国Sigma公司，软脂酸（PA）购自美国Sigma公司，DMEM高糖培育基购自美国Gibco公司，青霉素、链霉素购自上海碧云天生物技术研讨所，优级胎牛血清购自杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Abcam公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自北京索来宝生物公司，MDA和SOD检测试剂盒均为南京建成生物工程研讨所产品。endprint
1.3 L02细胞脂肪变模型的树立和分组
在超净工作台、无菌条件下，选用贴壁法培育L02，将细胞分为五组，别离是对照组、PA模型组、SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组。对照组：参加细胞培育液。PA模型组：培育24 h后，给予0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-L组：25 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-M组：50 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-H组：100 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。随后测定相应的目标。
1.4 MTT法检测细胞增殖生机
按上述分组，96孔板惯例培育，每组6个复孔。停止培育前4 h每孔参加10 μL MTT，培育结束时弃上清液，每孔参加100 μL DMSO，微孔板震动仪振动10 min，使用酶标仪调至490 nm波长测各组OD值。以对照组A值为对照，核算PA模型组、SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组的细胞存活率。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
搜集各组细胞，细胞用PBS洗刷2次。重悬细胞，用10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI避光常温孵育5 min，流式细胞仪剖析测得数据。
1.6 过氧化产品丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平的测定
按以上分组处理后，搜集培育板上的细胞和培育液，依照MDA和SOD检测试剂盒的规范操作流程，别离检测MDA含量、SOD水平。细胞分组培育6个复孔，取其均值。
1.7 统计学办法
选用SPSS16.0软件对数据进行统计剖析，计量材料以均数±规范差（x±s）标明，组间比较选用t查验，多组间比较选用单因素方差剖析，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 MTT法检测L02细胞的增殖生机
以不同浓度的SFPS预处理及PA孵育L02细胞后，MTT法检测各组细胞的增殖生机。肝细胞脂肪变性以0.5 mmol/L的PA效果L02细胞48 h为模型，细胞存活率为（64.7±2.5）%。在浓度25～100 μg/mL时，羊栖菜多糖可增强脂肪变肝细胞的增殖活性，差异有统计学含义（F=4.02，P<0.05）。SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组的细胞存活率别离升高至（70.0±3.0）%、（75.5±3.3）%、（84.1±3.7）%。
2.2 SFPS对细胞凋亡率的影响
对照组的细胞凋亡率为（5.1±2.0）%，而PA模型组L02细胞的凋亡率为（39.8±4.7）%。SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组的细胞凋亡率别离为（36.2±4.9）%、（27.8±2.9）%、（16.9±3.1）%，均显着下降（F=3.95，P<0.05）。阐明经过羊栖菜多糖的预处理可按捺脂肪变细胞凋亡，且有剂量依靠性（图1）。
2.3 SFPS对PA所构成的L02细胞氧化危害的影响
PA模型组上清液SOD活性显着低于对照组，预先参加不同浓度SFPS可添加SOD活性，其间50、100 μg/mL浓度组与模型组比较有显着性差异。PA模型组细胞MDA含量显着高于对照组，预先参加不同浓度SFPS各组MDA的含量下降，25、50、100 μg/mL浓度组与PA模型组比较均有显着性差异（P<0.05）。见表1。
表1 SFPS对PA所构成的L02氧化危害的维护效果（x±s，n=6）
注：#P<0.05，##P<0.01 vs对照组；*P<0.05，**P<0.01 vs PA模型组。各处理组细胞的SOD生机（F=3.74，P<0.05）和MDA含量（F=3.38，P<0.05）總体均数不全持平
3评论
NAFLD的病理机制标明氧化应激在其开展前期或许已存在危害。细胞经过呼吸使用氧发作ATP时，氧自由基或ROS的发作超越细胞的铲除解毒才能，细胞的氧化与抗氧化失调发作很多的氧化中心产品构成安排、细胞危害的状况称为氧化应激[11]。很多研讨依据标明过量脂肪酸导致线粒体氧化超负荷，ROS和RNS生成过多而积蓄[12]，导致脂质过氧化产品和细胞因子的开释，介导NAFLD的发作开展[13]。
不同性质的脂肪酸均可导致L02细胞发作以甘油三酯升高为特征的脂肪变性，对细胞有必定的毒性效果，可是饱满脂肪酸比不饱满脂肪酸更易构成细胞危害，它的脂毒性更强。一般无论是正常人仍是NAFLD患者，体内的软脂酸都是含量最多的一种饱满脂肪酸[14]。故本研讨选用软脂酸诱导L02构建肝细胞脂肪变模型。成果显现PA模型组L02细胞增殖活性显着下降，凋亡率添加，MDA含量升高，SOD水平下降，阐明跟着细胞内脂肪酸的堆积，引起氧化应激和脂质过氧化，导致细胞抗氧化因子过量耗费和抗氧化酶生机衰竭。
下降氧化应激危害、维护受损的肝细胞、削减肝细胞凋亡是医治NAFLD 的一个重要途径。羊栖菜多糖是一种水溶性多糖，首要以褐藻酸、褐藻糖胶和褐藻淀粉的方式存在，为非细胞毒性物质，具有天然、安全、有用的特色，故其已引起人们的遍及重视。已有试验证明，SFPS具有铲除自由基、进步抗氧化酶活性及按捺脂质过氧化的效果[15，16]。陈慧玲等[17]发现SFPS可剂量依靠性地按捺H2O2所构成的血管内皮细胞存活率的下降，阻挠LDH外漏，添加NO开释，并削减MDA生成，进步SOD活性。倪小芬等[18]报导SFPS可对立H2O2诱导的胰岛β细胞的凋亡，添加抗氧化酶活性。王贞丽等[19]研讨发现SFPS对氧化应激人成纤维细胞有维护效果。本试验发现给予25 μg/mL SFPS处理后，脂肪变肝细胞的MDA含量下降，细胞增殖活性添加，细胞凋亡率下降。当给予的SFPS浓度增大到50 μg/mL、100 μg/mL时，细胞增殖活性添加及细胞凋亡率下降的效应愈加显着，MDA含量逐步下降，SOD水平逐步升高，阐明SFPS能减轻PA引起的肝细胞氧化危害，且维护效果在必定范围内具有剂量效应联系。endprint
此外，羊栖菜多糖抗细胞凋亡的效果或许经过Bcl-2宗族调理的线粒体通路进行。该宗族中的Bax及Bcl-2可以正负调控凋亡进程，在必定条件下构成同二聚体及异二聚体导致线粒体的外膜通透性改动，决议了细胞的生计与逝世。当Bax的量相对增高时，则Bax同二聚体增多，促进细胞凋亡。而Bcl-2的量相对增高时，Bcl-2同二聚体增多，构成Bcl-2-Bax异二聚体，两者均能按捺细胞凋亡。文献报导[20]，羊栖菜多糖可以下降肝细胞株脂肪变模型中的Bax基因的表达，添加Bcl-2基因的表达，使两者比值发作改动，然后发挥抗细胞凋亡效果。
综上所述，本研讨经过软脂酸树立人正常肝细胞株脂肪变模型，调查羊栖菜多糖对氧化应激危害肝细胞的干涉效果，成果发现羊栖菜多糖能在必定程度上减轻氧化应激、抗细胞凋亡，但其详细效果机制仍需进一步研讨证明。
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（收稿日期：2017-08-15）endprint