mds不换骨髓能活多久 干扰素调理因子8在骨髓增生反常综合征伴原始细胞增多亚型中的表达研讨
徐旭栋 肖湘阳 陈龙 王剑超
[摘要] 意图 研讨干扰素调理因子8（interferon regulatory factor 8，IRF-8）在骨髓增生反常综合征伴原始细胞增多（Myelodysplastic Syndromes with Excess Blasts，MDS-EB）亚型中是否存在表达反常，并剖析其与MDS-EB的相關性。办法 搜集三组共30例试验标本。其间20例为MDS-EB病例标本，分为MDS-EB1组和MDS-EB2组。10例为健康体检的健康对照组。30例标本均搜集自受试者外周静脉血，搜集后当即进行外周血总RNA提取，并经逆转录PCR后，以实时荧光定量PCR检测各标本的IRF-8 mRNA表达水平。各组均匀表达量以RQ值（x±s）标明。 成果 三组样本实时荧光定量PCR的均匀RQ值：MDS-EB1组（0.59±0.08），MDS-EB2组（0.26±0.10），健康对照组（1.20±0.26），三组表达水平存在显着差异（P<0.01）。MDS-EB组的IRF-8表达水均匀显着低于健康对照组（P<0.01），MDS-EB2组内IRF-8表达水平低于MDS-EB1组（P<0.05）。 结论 IRF-8在MDS-EB中表达水平下降，标明IRF-8在MDS-EB中表达受抑，组间核算成果提示IRF-8的表达或许与疾病的恶性程度及开展相关。
[要害词] 干扰素调理因子8；骨髓增生反常综合征伴原始细胞增多；外周血RNA；逆转录PCR；实时荧光定量PCR
[中图分类号] R551.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）09-0043-05
Study on expression of interferon regulatory factor 8 in myelodysplastic syndromes with excess blasts subtype
XU Xudong1 XIAO Xiangyang1 CHEN Long1 WANG Jianchao2
1.Zhejiang Chinese Medicine University Second Clinical Medical College， Hangzhou 310053， China； 2.The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China
[Abstract] Objective To investigate whether the expression of interferon regulatory factor 8（IRF-8） is abnormal in myelodysplastic syndromes with excess blasts （MDS-EB） subtype and to analyze its correlation with MDS-EB. Methods A total of 30 experimental specimens from three groups were collected. 20 cases were MDS-EB case specimens and divided into MDS-EB1 group and MDS-EB2 group. 10 cases of healthy physical examination were as healthy control group. All the samples were collected from the peripheral venous blood of the subjects. The total RNA was extracted from the peripheral blood immediately after the collection. The expression level of IRF-8 mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR after reverse transcription PCR. The average expression of each group was expressed as RQ（x±s）. Results The mean RQ values of real-time fluorescent quantitative PCR in the three groups were MDS-EB1（0.59±0.08）， MDS-EB2（0.26±0.10）， healthy control（1.20±0.26）， and there was significant difference among the three groups（P<0.01）. The expression level of IRF-8 in MDS-EB group was significantly lower than that in the healthy control group（P<0.01）， and the expression level of IRF-8 in MDS-EB2 group was lower than that in MDS-EB1 group（P<0.05）. Conclusion The expression of IRF-8 in MDS-EB decreases， indicating that IRF-8 expression is inhibited in MDS-EB. Intergroup statistical results suggest that IRF-8 expression may be related to the degree of malignancy and progression of disease.
[Key words] Interferon regulatory factor 8； Myelodysplastic syndromes with excess Blasts； Peripheral blood RNA； Reverse transcription PCR； Real-time quantitative PCR
骨髓增生反常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一组源于髓系造血干细胞的克隆性疾病。依据WHO 2016年出书的确诊攻略，MDS现在首要有8种亚型[1]，其间病况程度较为严峻的亚型是骨髓增生反常综合征伴原始细胞增多（MDS-EB）。MDS-EB占一切MDS亚型中发病的34.2%[2]。MDS-EB的骨髓原始细胞数目可到达5%～19%，依据MDS世界预后积分体系（IPSS）的点评，MDS-EB一般可划分为中危或高危，均匀转白率挨近40%[3]，其发病及转白进程中，可存在多种基因位点的骤变和相关细胞因子的表达缄默沉静，但其机制尚不清晰。
干扰素调理因子（interferon regulatory factor，IRF）是一种具有抗病毒、抗肿瘤、调理机体免疫功用等多种功用的细胞因子[4]，IRF-8是其重要的宗族成员之一，在肿瘤发病以及抗肿瘤相关免疫中具有重要效果[5，6]。在血液肿瘤方面，IRF-8表达缺失是缓慢髓细胞性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）发病的重要分子事情，大多数CML患者的IRF-8 mRNA表达严峻缺少[7]。而相同作为血液肿瘤疾病的MDS-EB，现在还未有与IRF-8表达相关的研讨报导。
1材料与办法
1.1一般材料
挑选2014年12月～2016年12月搜集浙江中医药大学隶属第二医院血液科住院的MDS-EB患者20例作为研讨目标，并依据临床材料分为MDS-EB1组和MDS-EB2组。MDS-EB1组样本来自临床确诊的MDS-EB1患者，骨髓陈述提示原始细胞数>5%且<10%。MDS-EB2组样本来自临床确诊的MDS-EB2患者，骨髓陈述提示原始细胞数>10%且<20%。另搜集10例健康样本作为健康对照组，标本来自我院健康体检人群。一切当选者均签署知情同意书。20例MDS-EB患者及10例健康对照组均依据受试者临床特征、外周血象、骨髓细胞形态学等进行一致分组编号。临床特色见表1、2。
1.2办法
选用实时荧光定量PCR法测定外周血单个核细胞IRF-8 mRNA的表达水平。
1.2.1总RNA抽提 运用肝素抗凝管搜集新鲜外周血，天然沉积后搜集上清液，1000 rpm离心15 min，分装上清，-80℃冻存。沉积后的细胞部分以PBS洗刷，Ficoll别离外周血单个核细胞后，敏捷进行总RNA抽提。
1.2.2 OD260/OD280 抽提总RNA后，取2 μL总RNA样品，测定260 nm、280 nm的吸光值，核算OD260/OD280，测定其纯度和浓度。
1.2.3 IRF-8的相对表达量 运用SYBR荧光染料试剂盒对样本进行定量剖析，每个样本重复3次。引物由上海生工生物技能公司组成。IRF-8引物序列：上游引物5-TTGTTGCCAGGAAGATTAG-3，下流引物5-CAAAGGAGAAAGGAGGACA-3。核算机主动Ct剖析法取得各个反响孔的Ct值，核算不相同本的均匀Ct值，使用△△Ct法核算表达量。IRF-8用内参基因GAPDH进行校对，使用Step One Plus 2.2.3软件进行数据处理，依据公式2-△△Ct（RQ）核算IRF-8的相对表达量。
1.3核算学办法
选用SPSS17.0核算学软件进行数据剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）标明，组间比较选用方差剖析，再选用LSD-t查验行两两比较，P<0.05为差异具有核算学含义。
2成果
2.1 总RNA提取浓度检测
对30个标本进行总RNA提取后进行浓度测定，各组均匀浓度分别为MDS-EB1组（642±199）ng/μL，MDS-EB2组（495±110）ng/μL，健康對照组（514±88）ng/μL，详细数值见表3。各标本浓度契合进一步试验要求。
2.2实时荧光定量PCR成果
经过对三组样品进行实时荧光定量PCR检测，用内参基因GAPDH对成果进行校对。检测成果均匀RQ值：MDS-EB1组（0.59±0.08），MDS-EB2组（0.26±0.10），健康对照组（1.20±0.26），详细数值及表达水平见表4和图1。
选用SPSS17.0核算软件对三组数据进行成对样本查验，三组试验样本间表达量存在显着差异（P<0.01）。MDS-EB1组及MDS-EB2组的均匀IRF-8表达水均匀显着低于健康对照组（P<0.05），且MDS-EB2组的均匀表达水平显着低于MDS-EB1组（P<0.05）。
3评论
迄今为止，关于MDS发病及其演化机制尚无清晰结论，但一般以为骨髓免疫反常、基因水平改动、遗传学反常和细胞凋亡过度等是导致MDS骨髓造血干细胞克隆性病变的四大重要因素。近年来跟着分子生物学技能的开展，关于MDS的分子确诊研讨现已逐步成为热门，在WHO最新出书的2016年MDS确诊攻略中，提及了9种在MDS中80%～90%常见基因反常，包含SF3B1、TET2、SRSF2、ASXL1、DNMT3A、RUNX1、U2AF1、TP53和EZH2[1]。其间，SF3B1作为骨髓增生反常综合征伴环形铁粒幼红细胞增多（myelodysplastic syndrome with ring sideroblast，MDS-RS）十分重要的一个分子骤变位点，关于疾病的诊治具有重要含义[8]。但另一方面，与其他血液肿瘤不同，现在临床上反响MDS效果的生物符号物还十分有限[9]，尤其在MDS-EB这一亚型方面。
IRF-8是IFN-γ调控因子宗族的成员，关于髓系细胞生成十分重要[10]，其作为IFN-γ/STAT1信号通路的要害分子，参加JAK/STAT的调控进程[11]，并介导Fas、Bax、FLIP、JAK1和STAT1的表达完成实体瘤细胞凋亡[12，13]。Watanabe T等[14]也在IRF-/-的小鼠试验中发现，IRF-8在调理髓细胞生成、开展分解及成长进程中起着重要的决定性效果。别的也证明了IRF-8在急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）、CML中的肿瘤按捺功用，康复IRF-8的表达可拮抗Bcr/Abl的致瘤性效果[15]。
本研讨将IRF-8运用到MDS-EB中，经过检测其mRNA的表达水平剖析IRF-8的表达是否反常。试验成果显现相较于健康对照组，MDS-EB组的表达水平显着下降，标明IRF-8在MDS-EB发病进程中表达遭到显着按捺，提示IRF-8或许是一种MDS-EB的按捺基因，对MDS-EB发病具有按捺效果。别的MDS-EB组间比照显现MDS-EB2中IRF-8的表达水平比MDS-EB1更低，这或许与IRF-8调理骨髓细胞生成、促进髓细胞分解老练的效果有关[16]。因而IRF-8的表达按捺或许会形成骨髓细胞的老练妨碍，然后导致原始细胞数量添加，而原始细胞数量的添加与MDS-EB的发病和转白都具有亲近相关，提示IRF-8的表达水平关于MDS-EB的疾病开展具有重要提示效果。
本研讨中发现IRF-8在MDS-EB中表达存在按捺，而这种按捺或许触及多种分子机制，而且与肿瘤的发病开展相关。在一些实体瘤中，反常甲基化是肿瘤发病的重要原因之一，试验研讨标明，鼻咽癌和消化道肿瘤中，IRF-8启动子的反常甲基化会导致IRF-8表达按捺[17]，在肾细胞癌（RCC）中IRF-8作为功用性肿瘤按捺因子也常常发作甲基化[18]，而娄晔等[19]发现MDS-EB存在高甲基化状况，这或许与IRF-8的表达按捺相关。当然除甲基化外，组蛋白润饰等表观遗传机制也参加IRF-8的按捺表达。Banik等[20]研讨发现IRF-8对组蛋白脱乙酰酶按捺剂的抗肿瘤活性具有重要效果，而且确认了IRF-8-MMP3新的肿瘤发病机制。Wonyong Lee等[21]研讨标明甲基化试剂联合组蛋白脱乙酰酶按捺剂才干康复IRF-8 mRNA水平的表达，这说明多种IRF-8的按捺机制或许存在多种控制中心。而在对IRF8-/-的小鼠模型康复IRF-8表达能力后，证明IRF-8对AML和CML具有肿瘤按捺功用。因而，IRF-8关于MDS-EB也或许具有重要的按捺效果。
现在，一些肿瘤药物的开发研讨首要用于按捺肿瘤细胞的增殖，然后到达缓解疾病的效果。如华蟾素就具有体表里按捺人胰腺癌细胞增殖效果[22]，而根据多信号通路陈述基因关于这类药物按捺肿瘤开展的分子机制研讨具有重要效果。IRF-8作为多种细胞信号通路傍边的要害分子，其表达和按捺关于肿瘤开展及药物效果都具有重要的提示含义。因而进一步研讨IRF-8的分子机制不只能对MDS-EB的靶向医治奠定试验根底，还能关于华蟾素等肿瘤按捺药物在按捺肿瘤进程中的分子效果机制供给研讨价值。
另一方面，在MDS-EB的发病机制上，除遗传学反常以外，骨髓免疫反常也被以为是MDS-EB发病的一个重要原因。而骨髓免疫反常也是免疫相关性全血细胞削减症（immuno-related pancytopenia，IRP）的首要发病原因。这两种疾病都具有骨髓造血反常、贫血等类似的临床症状，因而在临床辨别上具有必定难度。IRP的发病机制一般以为与T淋巴细胞的调控反常有关，并伴有TH1、TH2、TH17阳性细胞份额反常[23，24]。而IRF-8在T淋巴细胞与B淋巴细胞的诱导分解上具有重要效果[25-28]，而且具有按捺Th17细胞分解的效果。所以，IRF-8不只在MDS-EB中存在反常表达，也或许在IRP中也有反常表达，因而进一步研讨IRF-8的效果与功用，关于这两种疾病发病机制的研讨和辨别均具有重要价值。
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（收稿日期：2017-02-05）