甲状腺乳头状癌复发率 cN0甲状腺乳头状癌中心区淋巴结微搬运的开始研讨
韩春++王可敬++张谷+徐加杰++郑伟慧
[摘要] 意图 探討cN0甲状腺乳头状癌中心区淋巴结的微搬运情况，评论逆转录聚合酶链反响（RT-qPCR）技能对确诊淋巴结微搬运灶的价值，并挑选微搬运的临床病理高危要素。 办法 选取2012年11月～2014年3月浙江省肿瘤医院收治的cN0甲状腺乳头状癌患者48例，对从中取到136个病理证明无搬运的中心区淋巴结别离用免疫组化和RT-qPCR检测CK19的表达情况。将患者的各项临床病理相关要素作为自变量，以淋巴结微搬运要素作为因变量，使用二分类变量Logistic回归模型进行多要素剖析，以期发现微搬运或许的高危要素。 成果 免疫组化检测CK19为15.44%（21/136），RT-qPCR法的阳性检出率为82.35%（112/136）。RT-qPCR 法与免疫组化法比较具有显着差异。Logistic回归模型中挑选出肿瘤甲状腺包膜侵略是cN0甲状腺乳头状癌中心区淋巴结微搬运的风险要素。 定论 使用RT-qPCR检测CK19表达，可进步对甲状腺癌的淋巴结微搬运阳性检出率。肿瘤甲状腺包膜侵略是淋巴结微搬运的独立风险要素。
[关键词] 甲状腺肿瘤；甲状腺乳头状癌；细胞角蛋白19；微搬运；聚合酶链反响
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）02-0001-04
Preliminary study of lymph node micrometastasis in the central compartment of cN0 papillary thyroid carcinoma
HAN Chun1 WANG Kejing1 ZHANG Gu2 XU Jiajie1 ZHENG Weihui1
1.Department of Head and Neck Surgery， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China； 2.Department of Pathology， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China
[Abstract] Objective To investigate the micrometastasis of lymph node in the central compartment of cN0 papillary thyroid carcinoma， to explore the value of reverse transcription polymerase chain reaction（RT-qPCR） in the diagnosis of lymph node micrometastasis， and to screen the clinical pathological risk factors of micrometastasis. Methods A total of 48 patients with cN0 thyroid papillary carcinoma who were admitted to Zhejiang Cancer Hospital from November 2012 to March 2014 were enrolled in this study. The expression of CK19 was detected by immunohistochemistry and RT-qPCR in 136 lymph nodes in the central zone collected from them， which was pathologically confirmed without metastasis. The clinicopathological factors of patients were taken as independent variables， and lymph node micrometastasis factors were taken as the dependent variables. Multivariate analysis was applied by binary variables Logistic regression model， so as to explore the possible risk factors of micrometastasis. Results CK19 was detected by immunohistochemistry in 15.44%（21/136）. The positive rate of CK19 was 82.35%（112/136） by RT-qPCR. RT-qPCR method and immunohistochemical method were compared， and the differences were significant. Logistic regression analysis showed that tumor thyroid capsule invasion was the risk factor of central zone lymph node micrometastasis in cN0 papillary thyroid carcinoma. Conclusion The test of CK19 expression by RT-qPCR can increase the positive detection rate of lymph node micrometastasis in thyroid carcinoma. Tumor thyroid capsule invasion is an independent risk factor for lymph node micrometastasis.
[Key words] Thyroid tumor； Papillary thyroid carcinoma； Cytokeratin 19； Micrometastases； Polymerase chain reaction（PCR）
甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的1%[1，2]，其间又以甲状腺乳头状癌所占份额最高，且近年来发病率呈增高的趋势。手术医治是现在临床医治甲状腺癌的首要办法，其间淋巴结搬运经常是手术医治面对的重要问题[3-5]。大都临床以为对无淋巴结搬运的患者进行扩展淋巴结打扫无临床含义，且会添加患者损害，进步術后并发症的发作率[6，7]。因而，怎么更好地判别淋巴结有无搬运风险，以辅导淋巴结打扫挑选和预后判别十分重要。
细胞角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19）是近年来发现的与肿瘤发作开展密切相关的一种肿瘤抗原，其强阳性表达预示着肿瘤的滋润潜能，与甲状腺癌的发作具有显着的相关性[8]。近年来，免疫组化办法检测蛋白标志物现已广泛用于乳头状甲状腺癌的确诊，其活络度还存在必定缺点[9，10]。本研讨经过免疫组化及RT-qPCR联合检测CK19的表达用于进步对甲状腺癌淋巴结微搬运的检测活络度和精确度，并结合患者临床病理要素，评论影响淋巴结微搬运的风险要素。
1 材料与办法
1.1 一般材料
研讨目标为我院肿瘤头颈外科于2012年11月～2014年3月收治的初治临床淋巴结阴性（clinical negative lymph node，cN0）甲状腺乳头状癌患者48例，其间男9例，女39例，中位年纪41（22，70）岁，>45岁36例，≤45岁12例；单发病灶35例（72.9%），多发病灶13例（27.1%）；双侧甲状腺癌5例（10.4%），单侧甲状腺癌43例（89.6%）；伴有包膜侵略23例（47.9%）；5例伴有腺内播散及砂砾体（10.4%）。术后病理依据美国癌症联合会（AJCC）2010年第7版癌症分期规范[11]：T1aN0M0 Ⅰ期19例；T1aN1aM0 Ⅰ期9例；T1aN1aM0 Ⅲ期5例；T1bN0M0 Ⅰ期6例；T1bN1aM0 Ⅲ期2例；T2N0M0 Ⅰ期1例；T2N1aM0期2例；T3N0M0 Ⅲ期1例；T3N1aM0 Ⅰ期2例；T3N1aM0 Ⅲ期1例。48例术前均接受了颈部超声、胸部CT和甲状腺功用查看。均经术中冰冻病理确诊为甲状腺乳头状癌。手术别离行单侧甲状腺及峡部切除或双侧甲状腺全切除术并实施患侧中心区淋巴结打扫术。
1.2 试验办法
手术均由同一医疗组完结。术中将48例患者行中心区打扫的淋巴结标本，每1枚均除掉周围脂肪纤维安排，沿最长轴于中心最大切面对半切开，标号后取其间的1/2标本获取接连切片两张，淋巴结中性福尔马林固定，白腊包埋。距离500 μm 接连分切淋巴结，切片厚度为4 μm，别离行HE染色惯例病理查看和免疫组化CK19检测，另一半淋巴结放置于液氮罐中冷冻，并贮存于-80℃ 的低温冰箱中用于提取mRNA荧光定量RT-PCR检测CK19的表达。依据术后惯例病理确诊成果，扫除HE切片证明病理搬运的淋巴结，选取HE切片病理未见癌搬运的淋巴结进一步行免疫组化及RT-qPCR检测。
1.2.1 免疫组化检测 悉数标本经10%中性甲醛固定后惯例白腊包埋，将淋巴结标本4 μm厚度接连切片、染色。切片均经微波抗原修正，选用免疫组化S-P 法检测，具体操作过程均依照试剂盒阐明书进行。CK19单克隆抗体别离购自丹麦 DAKO 公司和美国 Cell Marque 公司。选用 ZEISS ImagerZ1显微镜及VENTANA Image Viewer 3.1.3 图画软件。成果断定：CK19细胞染色均以细胞浆呈现的棕黄色颗粒为阳性规范。一切染色标本均进行数值丈量及染色强度断定，每张切片在高倍镜下（40倍）选取 5 个视界，依照阳性细胞所占百分数并参阅上色强度断定，行半定量积分法，一致断定成果[12]。按阳性细胞百分比记 0～4分，阳性细胞百分比<5%为0分，6%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分。阳性强度评分规范：不显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3分。两项目标的评分相加：0～1 分为阴性成果（-），2～3 分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（++），>5 分为强阳性（+++）。
1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反响（RT-qPCR）检测 选用实时荧光定量PCR检测 CK19 mRNA 的表达。淋巴结 RNA 提取和 cDNA 的组成以及 PCR 反响试剂均由广州达晖生物技能有限公司供给，严厉依照试剂阐明书进行。逆转录反响条件为 42℃1 h，70℃，15 min（仪器类型：ABI 2720 Thermal Cycle）。RT-qPCR法检测 CK19，其间PCR反响体系为 50 μL，扩增反响条件为：预变性95℃ 5 min，然后95℃ 15 s，60℃ 40 s，共45个循环。一起设置内参对照和空白对照（仪器类型：ABI Step One Plus TM Real-Time PCR Instrument）。CK19正向引物：5AGGAGATTGCCACCTACCG3，反向引物：5CC TTCCC ATCCCT CTACCC 3；内参基因GAPDH正向引物：5CTCTC TGCT CCTCCT GTTCGAC 3，反向引物：5GCCCAATACGACCAAATCCG 3。
1.3 统计学办法
选用SPSS 23.0 统计学软件进行统计剖析。数据为分类材料，CK19 mRNA拷贝数的比较选用χ2查验。剖析甲状腺癌患者 RT-qPCR 法检测CK19的阳性率，比照免疫组化与RT-qPCR法检测办法是否存在差异。多要素剖析选用二分类Logistic回归模型剖析。P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 免疫组化成果
48例 cN0 甲状腺癌患者中，术中共取到 212 枚中心区打扫淋巴结标本，均匀4.4枚。经病理证明搬运 76 枚，病理证明无搬运 136 枚。病理证明无搬运的136 枚淋巴结跋涉一步检测。依据上述免疫组化断定成果，CK19阳性的数目别离为 21例，余27例为无搬运患者。见封三图1。
2.2 RT-qPCR检测成果
选用Primer 5.0软件设计检测GAPDH、CK19引物，并进行2对引物扩增特异性剖析。2对引物具有较好的扩增特异性，能确保样品中意图基因准確检测，见封三图2～3。48例甲状腺癌患者的136枚病理证明无搬运淋巴结中，免疫组化CK19阳性数目为21枚。经过RT-qPCR检测CK19，阳性数目为112枚。CK19基因RT-qPCR检测法较免疫组化具有更高的阳性检出率，两种办法比较，差异有统计学含义[15.44（21/136） vs 82.35%（112/136），P<0.05]。见表1。
表1 CK19在免疫组化和 RT-qPCR两种办法中的表达比较
2.3 淋巴结微搬运的临床病理特征及影响要素
将患者的各项临床病理相关要素作为自变量，以淋巴结微搬运要素作为因变量，挑选淋巴结微搬运的风险要素。选用分类变量Logistic回归剖析：将性别、年纪、病理T分期、病灶个数、包膜侵略、单双侧、腺内播散等要素引进剖析，成果提示：包膜侵略是淋巴结微搬运的首要风险要素，其他变量比较差异无统计学含义（P>0.05），见表2。Logistic回归剖析成果见表3。
3 评论
甲状腺癌大都归于低度恶性、开展相对缓慢，未发作搬运的甲状腺癌患者术后10年生存率超越80%[13]。据统计超越90%的甲状腺乳头状癌可检测到淋巴结微搬运。微搬运是恶性肿瘤开展过程中播散于淋巴体系、血循环及骨髓等器官中的细小肿瘤细胞灶，是肿瘤部分复发和远处搬运的本源，是影响患者预后的要素，辨别是否发作淋巴结微搬运关于临床处理具有较大的辅导含义。关于有淋巴结累及的患者应行淋巴结打扫（包含中心区和/或侧颈部），但关于术前超声检测及术中探查未发现显着可疑淋巴结的患者是否应行惯例打扫仍有争议。现在为止，还没有十分牢靠的技能和检测目标能用于精确评价甲状腺癌的搬运。
CK19是一种低分子量角蛋白，首要在上皮细胞中表达，但不会在间质安排中表达，是一个上皮安排来历肿瘤特异的微搬运标志物[14]。在甲状腺癌中能够激烈而充满的表达，而在正常甲状腺安排、结节性甲状腺肿中不表达或灶状表达，可用于猜测甲状腺癌淋巴结微搬运。已有不少研讨显现：CK19的表达能反映甲状腺乳头状癌淋巴结微搬运的情况[15-17]。
运用RT-qPCR技能比照现在遍及选用的HE染色技能对淋巴结微搬运的检测剖析比较，RT-qPCR 技能是较为活络的办法，能够检测淋巴结的细小搬运。本研讨用免疫组化和RT-qPCR办法对136枚甲状腺癌淋巴结安排的CK19进行检测，其间RT-qPCR法阳性检出率更高，两种检测办法比较差异具有统计学含义（P<0.05）。在本研讨中可见RT-qPCR 技能比免疫组化更灵敏。因而，在印象学查看及触诊未及颈淋巴结的cN0患者中，可对打扫术后病理阴性淋巴结标本进一步使用RT-qPCR技能检测淋巴结微搬运的情况。关于RT-qPCR检测成果阳性的患者可考虑挑选较为活跃的医治战略如颈淋巴结打扫术，或紧密随访必要时手术。反之则可挑选暂不可淋巴结打扫，定时复查。
检测甲状腺乳头状癌淋巴结微搬运可作为病理情况的有用弥补，但本研讨成果显现，cN0甲状腺乳头状癌淋巴结的微搬运与甲状腺癌患者大部分的临床病理高危要素无显着统计学差异。张磊等[18]在cN0甲状腺乳头状癌惯例病理淋巴结搬运的多要素剖析中显现非细小癌、男性、年纪<40岁是淋巴结搬运的高危要素。一些研讨[19-23]也以为男性，年纪<45岁、肿瘤有腺外侵略、多病灶者，淋巴结搬运发作率显着添加。但本研讨中在肿瘤的巨细、性别、年纪这三个要素中，均未显现是淋巴结微搬运的风险要素。一方面与本研讨的样本量小有关，另一方面也提示，淋巴结微搬运的高危要素的挑选较惯例病理的搬运更为困难，阐明微搬运发作在较早的肿瘤开展过程中，猜测该相关要素与临床病理特征，需求进一步深入研讨。
本研讨发现甲状腺包膜侵略这一要素是淋巴结微搬运的独立风险要素。优势比OR=4.000意味着伴有包膜侵略的患者，发作淋巴结微搬运的风险是无包膜侵略的4倍。因而伴有包膜侵略的患者需求更多的重视淋巴结的处理办法，包含中心区淋巴结的活跃打扫，右侧甲状腺癌的患者，还有必要行右侧喉返神经深面淋巴结的打扫等。
总归，本研讨一方面以为RT-qPCR法检测甲状腺癌微搬运具有相对优势。另一方面，淋巴结微搬运的猜测模型的优化树立需求扩展样本量，并重视包膜侵略这一要素，具有必定的临床辅导含义。
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（收稿日期：2016-06-12）