亚胺培南是碳青霉烯类抗生素 盐酸小檗碱和亚胺培南联合效果耐碳青酶烯类铜绿假单胞菌的体外药敏试验研讨
石庆新 吕小萍 於青峰 杨阳
[摘要] 意图 评论盐酸小檗碱和亚胺培南联合效果对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（CPA）体外抗菌活性的影响。办法 试验选用肉汤稀释法测定盐酸小檗碱和亚胺培南耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌最小抑菌浓度（MIC）；选用棋盘稀释法测定盐酸小檗碱联合亚胺培南对CPA的MIC，并核算联合指数（FIC）。 成果 盐酸小檗碱和亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC的算术均数分为268.80 μg/mL和8.93 μg/mL。用亚胺培南与盐酸小檗碱联合效果后，盐酸小檗碱与亚胺培南MIC的算术均数别离降至8.16 μg/mL和4.50 μg/mL。两种药物联合运用对6.7%的60株CPA有协同的抗菌效果，对88.3%CPA出现相加效果，对5.0%CPA出现无关效果，无拮抗效果。 定论 盐酸小檗碱和亚胺培南联合效果能够添加两者对CPA抗菌效果的敏感性。
[关键词] 盐酸小檗碱；铜绿假单胞菌；协同效果；碳青霉烯酶；亚胺培南
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）01-0114-04
铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，也是医院院内感染的重要致病菌[1]，常引起呼吸道感染、败血症、创伤感染、尿路感染等，近年来其别离率和耐药率都不断的呈上升趋势[2]。依据2013年全国细菌耐药监测数据，铜绿假单胞菌对碳青霉稀类的耐药率到达25%以上，且出现了广泛耐药菌株[3]。铜绿假单胞菌对立菌药物耐药局势十分严峻，给临床医治带来了难题。
盐酸小渠碱是中药黄连提取物，也是一种生物碱，《我国药典》记载黄连和盐酸小檗碱具有抗菌消炎等药理效果[4]。有关盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的抗菌效果研讨很少。本试验拟经过盐酸小檗碱和亚胺培南的体外联合药敏试验研讨，点评两种药物的联合用药的抗菌效果。为临床医治耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌“超级细菌” 供给试验依据和新的医治思路。
1 资料与办法
1.1 资料
1.1.1 菌株 在2014年1月1日～2015年12月31日期间，从台州恩惠医院和台州路桥医院住院患者中各别离40株和60株CPA（除掉重复别离菌株）。100株临床菌株经过法国梅里埃VITEK2-CompactT检测，然后经过Hodge试验[5]承认筛选出耐碳氢酶烯类铜绿假单胞菌60株。质控菌株27853购于我国卫生部临检中心。
1.1.2 抗菌药物 盐酸小檗碱剖析规范品批号为160528，纯度98%，规范1 g/支；亚胺培南批号为160421，纯度98%，规范5 g/支，购于上海源叶生物科技有限公司。
1.2 办法
1.2.1 菌悬液的制备 试验前将一切保存菌种经复融、转种、别离培育，在同一平板上取性状类似1～2个菌落，接种到LB液体培育基内10～12 h。再用 RPMI1640液体培育基调理细菌LB培育液使其密度为2～6×108 CFU/L 菌悬液备用。试验时再将备用菌悬液用RPMI1640培育基稀释到100倍，终究密度为2～6×106 CFU/L接种菌悬液。
1.2.2 药物浓度的制造 先用无菌蒸馏水把盐酸小檗碱和亚胺培南干粉碱别离配成2048 μg/mL和256 μg/mL的原液。NCCLS抗生素药敏微量稀释原理：盐酸小檗碱开始浓度为2048 μg/ml，第1孔的浓度为2048 μg/mL，然后再用RPMI1640液稀释对药物进行倍比稀释，稀释到第10管孔浓度为2 μg/mL，得到的盐酸小檗碱的浓度规模在2～1024 μg/mL之间。亚胺培南开始浓度为256 μg/mL，用相同的办法稀释终究得到亚胺培南的浓度规模在0.125～128 μg/mL之间。
1.2.3 盐酸小檗碱和亚胺培南独自药敏试验 依据NCCLS微量倍比稀释原理在96孔的V型检测板参加药敏原液并稀释至第10孔为最低检测浓度的2倍，然后再第1孔至第11孔参加50 μL稀释好的菌懸液，使终究每孔菌液浓度为l×105 CFU/mL，第11孔为不加细菌的对照孔，第12孔为空白对照孔。然后混匀加盖置37℃孵育箱，18～24 h后调查成果。
1.2.4 盐酸小檗碱穿插联合抗真菌药物药敏试验 选用棋盘微量稀释法检测药物的联合效果，选用9个稀释度，药物最高浓度为其MIC的4倍，顺次倍比稀释为1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍浓度，两种药物稀释别离在96孔培育板上按横和纵两列进行联合[7]。接种菌量为1×105 CFU/mL，铜绿假单胞菌别离于37℃孵育18～24 h后调查细菌成长状况。用部分抑菌浓度指数（FIC）作为点评联合药敏试验效果。
1.2.5 FIC的核算及断定规范[6] FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用成果判别：①FIC指数≤0.5断定甲乙两药为协同效果；②0.5
2 成果
2.1 单药效果
盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌MIC规模为256～512 μg/mL，MIC几许均值为265.02 μg/mL；亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC规模为8～32 μg/mL MIC几许均值为8.57 μg/mL。
2.2 联合用药
两种药物联合运用时，盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌MIC减至为2～32 μg/mL；亚胺培南对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌MIC减至为2～16 μg/mL见表1。两种药物对6.7%的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌有协同的抗菌效果，88.3%耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌出现相加效果，对5.0%耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌出现无关效果，无拮抗效果，见表1。
2.3 亚胺培南与盐酸小檗碱独自运用和联合运用状况下MIC比较
亚胺培南独自运用和其与盐酸小檗碱联合运用时MIC值的比较选用t查验，两者存在显着性差异（t=15.11，P=0.00<0.01）。相同盐酸小檗碱独自运用和其与亚胺培南联合运用时的MIC值比较，存在显着性差异（t=36.18，P=0.00<0.01）。见表2。
3 评论
铜绿假单胞菌是革兰阴性非发酵菌，存在正常人的皮肤、肠道和呼吸道等部位。跟着抗生素不合理运用及广泛运用，铜绿假单胞菌对立菌药物耐药率也不断上升，对多种耐药乃至简直悉数抗生素耐药，这给医治铜绿假单胞菌所造成的感染带来了巨大的应战，使其成为所谓的“超级细菌”[8]。本课题从中西药联合运用的视点探究医治耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌办法。
从成果来看，用微量稀释法检测耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌对亚胺培南的MIC均值为8.93 μg/mL，此成果与仪器法检测的MIC规模是共同，其判别规范严厉依照美国临床和试验室规范协会（CLSI）药敏试验的规范[9]。中药提取物盐酸小檗碱对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌也具有抗菌效果，独自运用时其MIC的浓度为268.80 μg/mL。这个浓度比Sun Y等[10]的试验成果偏高。或许是因为咱们试验组挑选的菌株耐药性与他们试验组不同；他们试验的菌株是一般铜绿假单胞菌，而咱们组挑选的菌株全都是耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌。现在本文以为铜绿假单胞菌耐碳氢酶烯类机制有以下几点：（1）产金属酶，其能够水解碳氢酶烯类和一切β-内酰胺类抗生素，而且不被β-内酰胺酶按捺剂所按捺[11]，经过染色体和质粒介导耐药基因，首要在铜绿假单胞菌和其他非发酵菌之间传达。其基因分型分为GIM型1、VIM、 SPM、IMP等，在我国临床别离的耐药菌株以VIM、IMP基因型为主[12，13]。（2）药物效果靶位的改动：β-内胺类抗菌药物与细菌细胞膜上特定靶位相结合后，按捺细菌细胞壁肽聚糖分子组成，导致细菌溶解逝世。在对临床别离亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌株中，发现细菌耐药性与青霉素结合蛋白的改动关系密切，与细胞膜通透性改动呈协同效果[14]。（3）外排体系耐药是外膜蛋白形成了自动外排体系，开口于外膜的复合物，能够直接使药物泵出到细菌体外。当其表达增高时导致耐药，现在发现7种自动外排体系，均归于RND宗族，Mexab-OprM是在铜绿假单胞菌中最先发现RND宗族外排体系，其效果的底物广泛，最有临床意义的药物外排体系[15]。（4）膜的通透性下降：铜绿假单胞菌的细胞膜就有分子筛效果，阻挠抗菌药物进入到细胞内。大多数抗菌药物依据分子量的巨细经过膜孔蛋白通道进入到细胞。铜绿假单胞菌中与碳青霉碳青霉烯类药物相关的膜孔蛋白少，OprD是现在研讨发现引起碳青霉烯类抗生素耐药膜孔蛋白。OprD膜孔蛋白表达缺失或下调是导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的首要机制之一[11]。假如临床别离到耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌，一般对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、β-内酰胺酶按捺剂类、氨基糖苷类类等药物出现协同耐药[16]，临床医师对此束手无策，到无药可用的地步，进而导致患者逝世率增高，就需要寻觅新的医治药物和新的医治计划。
本试验数据标明两种药物联合运用的状况下，亚胺培南的药物浓度均匀下降本来的一半，盐酸小檗碱的药物浓度从268.80 μg/mL均匀降到8.16 μg/mL，依据查验的成果两药联合运用与两药独自运用存在显着性差异，西药亚胺培南和中药盐酸小檗碱联合运用对95%的耐药菌株具有较抱负的抑菌效果；能够增强互相的抗菌才能。在谭拂晓等[17]研讨中阐明黄连提取物别离与氨苄西林和头孢他啶联合运用能够下降患者血液培育阳性率；黄连提取物能够进步氨苄青霉素和头孢菌素医治大鼠铜绿假单胞菌感染的效果。这与本试验成果根本相共同，盐酸小渠碱与药物合用能够进步药物的效果，与单用抗生素组比较，差异有显着性（P<0.01）。相同在丁彩云等[18]的头孢哌酮舒巴坦与小檗碱合用医治福氏志贺菌痢疾50例研讨中也阐明这一观念，头孢哌酮舒巴坦与盐酸小檗碱合用治療有效率为100%，显着高于单用头孢哌酮舒巴坦的70%。盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的抑菌或许灭菌机制是经过添加细胞膜的通透性[19]，当细菌的细胞膜通透性添加时，抗菌药物就比较简单经过细胞膜进入细胞内，抗菌效能添加，药物MIC就会下降。碳青霉烯类药物和盐酸小檗碱合用时，其MIC也会下降，与本试验相符。
综上，盐酸小檗碱与亚胺培南联合运用按捺铜绿假单胞菌的才能显着高于独自运用盐酸小檗碱或亚胺培南药物。为临床医治耐碳青霉烯铜绿假单胞菌供给理论依据。盐酸小檗碱除了添加细胞膜的通透性以外，或许存在其他的抗菌机制，还有待进一步研讨证明。
[参考文献]
[1] SHI Qingxin，YE Lihong，XU Chengxin. Carbapenem-resistance mechanism study of pseudomonas aeruginosa isolated from ICU patients[J]. China Modern doctor，2012，50（7）：29-30.
[2] Fournier D，Richardot C，Muller E，et al. Complexity of resistancemechanisms to imipenem in intensive care unit strains of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Antimicrob Chemo-ther，2013，68 （8）：1772-1780.
[3] 胡付品，朱德妹，汪复，等. 2013年我国细菌耐药性监测[J].中华感染与化疗杂志，2014，14（5）：365-374.
[4] 刘萍，向灿辉，邓镇涛，等. 黄连盐酸小檗碱的提取判定及抑菌活性研讨[J]. 食物与生物，2011，26（1）：3-4.
[5] 王兴力，多丽波. 铜绿假单胞菌产金属酶及其检测办法研讨[J]. 我国卫生查验杂志，2012，22（9）：2252-2254.
[6] 李艳敏，骆婷婷，王华富. 大蒜素联合头孢哌酮对多重耐药鲍曼不动杆菌体外抗菌活性的影响[J]. 我国现代医师杂志，2013，51（21）：68-69.
[7] 厉世笑，周鹏，朱珊珊，等. 丹参酮联合头孢他啶、哌拉西林钠他唑巴坦对多重耐药铜绿假单胞菌的体外抗菌效果的研讨[J]. 我国卫生查验杂志，2015 ，25（7）：1096-1097.
[8] Olivares PJ，Alvarez Ortega C，Luis MJ. Metabolic compensation of fitness costs associated with overexpression of the multidrug Ef-flux pump mex EF-OprN in pseudomonas aeruginosa[J]. Antimi-crob Agents Chemother，2014，58（7）：3904-3913.
[9] National committee for clinical laboratory standards（NCCLS）. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically，M100-s24[S]. Pennsylvania：NCCLS，2014.
[10] Sun Y，Li N，Lu Y，et al. In vitro antibacterial activity of allicin in combination with berberine hydrochlo-ride[J]. Chinese Traditional Patent Medicine，2015，37（12）：2589-2595.
[11] Li MW，Wei LH，MO Shanying，et al. Drug resistance analysis of carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa in general hospitals[J]. Modern Preventive Medicine，2013，40（18）：3454-3456.
[12] 张亦婷，应利君，周蕾，等. ICU铜绿假单胞菌耐亚胺培南的风险要素及耐药机制研讨[J]. 我国消毒学杂志，2015，32（10）：1052-10534.
[13] Wang J，Zheng XM，Lan HL，et al. Study of drug resistance mechangisms of multidrug-resistance Pseudomons aeruginosa to β-lactams[J]. Chinese Journal of Nosocomiology，2015，25（16）：3620-3623.
[14] 李苏利，华川. 铜绿假单胞菌多重耐药及泛耐药研讨进展[J]. 山西医药杂志，2013，42（8）：891-892.
[15] 吳祥林，肖丽霞，马东礼，等. 多重耐药铜绿假单胞菌Mexab-OprM的表达及MexR基因的骤变[J]. 世界查验医学杂志，2013，34（3）：288-290.
[16] Tang HF，Li WL，Liu WD. With overexpression of the multidrug Ef-flux pump mex EF-Opr N in pseudomonas aeruginosa[J]. Chinese Journal of Microecology，2012，24（7）：640-642.
[17] Tan LM，Tang XY，Zhao M，et al. The effect of Chinese traditional medicine（Coptis，Scutellaria baicalensis） on infection wound due to Pseudomonas aeruginos on scald rats[J]. J Hunan Normal Univ（Med Sci），2011，8（1）：79-81.
[18] 丁彩云，张雪娜. 头孢哌酮舒巴坦与小檗碱合用医治福氏志贺菌痢疾50例[J]. 底层医学论坛，2016，20（3）：321-322.
[19] 王平，夏飞，叶丽华，等. 黄连对铜绿假单胞菌生物学特性的影响及机制[J]. 中药药理与临床，2013，29（2）：83-84.
（收稿日期：2016-10-21）