食管鳞状细胞癌 MicroRNA—22—3p在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义
王江峰++陈晟++凌志强
[摘要] 意图 评论MicroRNA-22-3p（miR-22-3p）在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）安排中的表达状况，并剖析miR-22-3p与食管鳞状细胞癌临床病理特征、预后之间的联系。 办法 选用实时荧光定量聚合酶链反响法（qPCR）检测miR-22-3p在77例ESCC安排和癌旁正常安排中的表达差异及其与食管鳞状细胞癌的临床病理特征、预后的相关性。 成果 miR-22-3p不同程度高表达36.4%（28/77），正常表达20.8%（16/77），低表达42.8%（33/77）。miR-22-3p相对高表达的患者无病生计期较非高表达患者长（P<0.05），但miR-22-3p的表达水平与临床病理特征（性别、年纪、肿瘤方位、分解程度、滋润程度、淋巴结搬运、TNM分期、肿瘤宗族史、吸烟和喝酒）之间均无相关性（P>0.05）。 定论 miR-22-3p在食管癌的发作发展中起着抑癌因子的效果，其高表达能延伸食管癌患者的生计时刻。
[关键词] miR-22-3p；食管鳞状细胞癌；无病生计期；抑癌因子
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）27-0001-04
肿瘤是发达国家中最首要的逝世原因，在发展中国家位居第二。食管癌的发病率和逝世率在世界范围内位居第六[1]。鳞状细胞癌和腺癌是食管癌的首要病理类型，鳞状细胞癌首要坐落食管中上段，占食管癌的90%；其他少部分为腺癌，一般坐落食管下段[2]。食管鳞状细胞癌确诊往往已属晚期，侵袭和搬运的患者预后欠安。现在仍未发现食管鳞状细胞癌高度特异性符号物，因而前期确诊食管鳞状细胞癌好不容易[3]。细小RNA（microRNA）是一类22nt左右片段巨细的、具有高度安排特异性的非编码RNA，对确诊肿瘤的病理类型和来历具有潜在含义[4]。Real-Time PCR可检测食管鳞状细胞癌患者安排中miR-22-3p的相对表达状况，剖析miR-22-3p与食管鳞状细胞癌的病理特征和患者预后之间的联系。本文首要研讨miR-22-3p的相对表达状况对食管癌的发作、发展及搬运的效果及猜测功用，为食管鳞状细胞癌的搬运潜能和患者预后评价供给理论依据。现报导如下。
1材料与办法
1.1一般材料
搜集77例ESCC安排及癌旁正常安排，病例来自于2008年2月～2009年11月我院食管癌手术后安排标本（病理科清晰确诊食管鳞癌），女7例，男70例，年纪46～81岁，均匀64.4岁。术前未经任何放化疗，扫除本身免疫性疾病及严峻感染性疾病。癌旁正常安排取自肿瘤边际5 cm外区域肉眼下正常食管安排；术后标本当即保存于液氮中，并搬运至浙江省肿瘤研讨所，提取总RNA，转录cDNA后保存于-80℃冰箱待试验用。安排标本TNM分期和分级：高/中分解55例，低分解22例；Ⅰ/Ⅱ期39例，Ⅲ/Ⅳ期38例；伴淋巴结搬运44例，无淋巴结搬运33例。本研讨经医院道德委员会审批同意，电话随访患者，随访截止时刻设定为2013年3月25日。
1.2 试剂
RNA提取试剂盒为Qiagen公司的MirNeasy Mini Kit，Prime ScriptR miRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）反转录试剂盒和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR 081A）real-time PCR试剂盒均购于TaKaRa公司。试验引物（上海捷瑞）：miR-22-3p：5-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3，U6：5-CGCTTCGGCAGCACA-TATAC-3。
1.3 试验办法
1.3.1 提取总RNA 肿瘤安排及对应正常安排的总RNA依照MirNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取，总RNA的浓度和纯度由紫外分光光度计检测：A260/A 280范围在1.8～2.1间的样本用于后续试验。
1.3.2 转录RNA 将上述提取总RNA（1 μg）按说明书供给的反响条件设置温度，在PCR仪上进行cDNA的逆转录。
1.3.3 cDNA扩增 ABI 7500PCR仪（Applied Biosystems）剖析RT-PCR的PCR扩增及溶解曲线。反响系统20 μL，具体操作按SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书进程。PCR反响进程：激活聚合酶50 ℃ 2 min，预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 34 s，40个循环扩增。PCR溶解曲线：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。设复孔3个取均值核算。按2-△△CT法剖析成果：△CT=Ct（miR-22-3p）- Ct（U6）；按△△CT=△CT（癌安排）-△CT（癌旁正常安排）核算miR-22-3p在食管鳞状细胞癌安排和癌旁正常安排中相对表达状况，表达下降：△△CT>1；表达正常：-1≤△△CT≤1；表达升高：△△CT<-1，设定癌旁正常安排miR-22-3p相对均匀表达量为1，其他组表达量为2-△△CT核算，终究核算相对改动倍数。将一切样本分为高表达组和非高表达组，将临床病理特征设定为1或许0，并核算各组别例数，χ2查验核算两组别例数是否有核算学差异。电话随访核算各例患者的生计时刻（月），依据分组状况选用乘积极限法（Kaplan-Meier）进行单要素生计剖析。
1.4 核算学剖析
使用SPSS18.0核算软件，计量材料以（x±s）标明，选用单要素ANOVA比较各组表达倍数；计数材料以率标明，选用χ2查验比较各组表达状况和临床病理特征联系；选用乘积极限法（Kaplan-Meier）进行单要素生计剖析。P<0.05为差异有核算学含义。
2 成果
2.1 miR-22-3p相对表达比较
miR-22-3p在食管鳞状细胞癌安排相对癌旁正常安排高表达28例（36.4%），相对正常表达16例（20.8%），相对低表达33例（42.8%）。设定正常安排miR-22-3p相对均匀表达量为1，其中高表达组食管癌的均匀表达量为（16.07±5.94），正常组为（0.92±0.36），下降组为（0.13±0.03），高表达组相对表达量与正常组和下降组比较差异有核算学含义（P<0.05）。各组其他样本相对表达倍数见图1。
2.2 miR-22-3p相对表达状况与临床病理特征的联系
miR-22-3p相对表达状况与食管鳞状细胞癌临床病理特征的联系经过χ2查验剖析：高表达组和非高表达组中miR-22-3p表达水平与临床病理特征（性别、年纪、肿瘤方位、分解程度、淋巴结搬运、滋润程度、肿瘤宗族史、TNM分期、吸烟和喝酒）之间均无明显相关性（P>0.05），见表1。
2.3 miR-22-3p表达水平与预后的联系
按miR-22-3p相对表达状况将77例食管鳞癌患者分为高表达组和非高表达组，两组患者的无病生计期选用K-M法剖析比较，试验成果显现高表达组相较非高表达组更具有生计优势（r=0.862，P=0.016），见图2。
3 评论
最近研讨[5-8]发现miR-22-3p在前列腺癌中高表达，而在肾细胞癌、乳腺癌、胆管癌和多发性骨髓瘤中低表达，鲜有报导miR-22-3p在食管鳞状细胞癌中的表达状况和临床含义。本研讨选用实时定量PCR法检测食管鳞状细胞癌安排中miR-22-3p相对表达状况，剖析研讨miR-22-3p的相对表达状况对食管癌的发作、发展及搬运的效果及猜测功用，为食管鳞状细胞癌的搬运潜能和患者预后评价供给理论依据。
本研讨检测了miR-22-3p在食管鳞癌中的表达状况和临床病理及患者预后的联系，成果标明：在77例食管鳞癌安排标本中，miR-22-3p高表达为28例，正常表达16例，低表达33例。miR-22-3p高表达与临床病理特征之间无相关性（P>0.05），但部分目标如滋润程度和淋巴结搬运P值挨近0.05，猜测 miR-22-3p高表达或许与按捺肿瘤细胞的滋润和淋巴结搬运存在必定相关性；miR-22-3p高表达的患者生计时刻延伸，标明miR-22-3p能改进食管鳞癌患者的预后。
本研讨证明miR-22-3p在食管鳞癌中高表达患者的预后较非高表达患者好，两者的差异具有核算学含义，与Zhang等[9]研讨miR-22在肝癌中的表达状况和预后等联系成果相一致，一起他们在肝癌细胞中研讨还发现miR-22体外按捺肝癌细胞的增殖和搬运，其机制或许与miR-22调控HDAC4基因相关。本研讨证明miR-22-3p表达水平与临床特征如性别、年纪、肿瘤方位、淋巴结搬运、TNM分期、滋润程度、吸烟和喝酒无相关性（P>0.05），与Zhang等[10]研讨 miR-22的表达在结直肠癌中的临床含义的成果相一致，miR-22在结直肠癌安排中的表达较正常安排低，miR-22的表达水平缓结直肠癌患者的年纪、性别、肿瘤巨细、安排学类型、滋润深度、淋巴结搬运、肿瘤的方位和淋巴管滋润不相关（P>0.05）；对立的是Zhang等研讨发现miR-22的表达水平与肝搬运相关（P<0.05），或许与本研讨标本量小及标本来历不同有关。
Guo等[11]研讨miR-22的表达状况与胃癌联系相同发现：miR-22或许在胃癌的发展中也发挥着重要的效果。一起在细胞层面研讨发现，miR-22或许是经过调控Sp1基因来按捺胃癌细胞的搬运和滋润。Xu等[12]研讨miR-22的表达状况与肿瘤的联系的机制发现：miR-22是一种新式的经过细胞变老机制调控肿瘤细胞和正常细胞。miR-22在体表里经过促进肿瘤细胞的变老来阻挠肿瘤细胞的发展，miR-22或许首要以SIRT1、Sp1和CDK6基由于靶基因，经过这三个基因的细胞变老信号通路，终究以p53或pRb通路来按捺肿瘤细胞增殖、滋润和发展。
Fan等[13]研讨发现miR-22在肾细胞癌中低表达，但体外细胞试验研讨发现：miR-22按捺786-0和A498细胞增殖、搬运和滋润。miR-22或许经过效果于PTEN靶基因发挥抑癌基因的效果。在急性髓系白血病研讨中，Jiang等[14]发现miR-22在急性髓系白血病中低表达，且发挥着一个潜在抗肿瘤基因效果。miR-22经过调控多个癌基因（CRTC1、FLT3、MYCBP），按捺CREB和MYC通路发挥效果。miR-22在急性髓系白血病中低表达是由TET1/GFI1/EZH2/SIN3A通路按捺和（或）基因组DNA丢失。与此一起，纳米粒子带着miR-22寡核苷酸在体内明显按捺白血病发展[15-22]，一起，本文研讨提醒TET1/GFI1/EZH2/SIN3A/miR-22/CREB-MYC信号电路，供给了表观遗传/遗传机制，并强调了miR-22在临床上医治急性髓系白血病的潜力。
本研讨成果显现miR-22-3p是一种按捺食管鳞癌发作、发展的小分子RNA，其相对高表达能延伸患者的生计时刻，且改进预后。本研讨开始证明了miR-22-3p的相对表达状况和食管鳞癌预后的相关性，其高表达或许下降食管鳞癌的滋润和淋巴结搬运，但细胞机制和分子生物学研讨仍需进一步探究。
[参考文献]
[1] Ahmedin Jemal，Freddie Bray，Melissa M，et al. Global cancer statistics[J]. Ca Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.
[2] Jemal A，Center MM，Desantis C，et al. Global patterns of cancer incidence and mortality rates and trends[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19（8）：1893-1907.
[3] Fareed KR，Kaye P，Soomro IN，et al. Biomarkers of response to therapy in oesophago-gastric cancer[J]. Gut，2009，58（1）：127-143.
[4] Rosenfeld N，Aharonov R，Meiri E，et al. MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin[J]. Nat Biotechnol，2008， 26（4）：462-469.
[5] Kawahigashi Y，Mishima T，Mizuguchi Y，et al. MicroRNA profiling of human intrahepatic cholangiocarcinoma cell lines reveals biliary epithelial cell-specific microRNAs[J]. J Nippon Med Sch，2009，76（4）：188-197.
[6] Lionetti M，Agnelli L，Mosca L，et al. Integrative high-resolution microarray analysis of human myeloma cell lines reveals deregulated miRNA expression associated with allelic imbalances and gene expression profiles[J]. Genes Chromosomes Cancer，2009，48（6）：521-531.
[7] Poliseno L，Salmena L，Riccardi L，et al. Identification of the miR-106b～25 microRNA cluster as aproto-oncogenic PTEN-targeting intron that cooperates with its host gene MCM7 in transformation[J]. Sci Signal，2010，3（117）：ra29.
[8] Xiong J，Yu D，Wei N，et al. An estrogen receptor alpha suppressor，microRNA-22，is downregulated in estrogen receptor alpha-positive human breast cancer cell lines and clinical samples[J]. FEBS J，2010，277（7）：1684-1694.
[9] Zhang J，YangY，Yang T，et al. MicroRNA-22，downregulated in hepatocellular carcinoma and correlated with prognosis，suppresses cell proliferation and tumourigenicity[J]. British Journal of Cancer，2010，103（8）：1215-1220.
[10] Zhang GJ，Xia SS，Tian HP，et al. Clinical significance of miR-22 expression in patientswith colorectal cancer[J]. Med Onco，2012，29（5）：3108-3112.
[11] Guo MM，Hu LH，Wang YQ，et al. miR-22 is down-regulated in gastric cancer，and its overexpression inhibits cell migration and invasion via targeting transcription factor Sp1[J]. Med Oncol，2013，30（2）：542.
[12] Xu D，Takeshita F，Hino Y，et al. miR-22 represses cancer progression by inducing cellular senescence[J]. J Cell Biol，2011，193（2）：409-424.
[13] Fan W，Huang J，Xiao H，et al. MicroRNA-22 is downregulated in clear cell renal cell carcinoma，and inhibits cell growth，migration and invasion by targeting PTEN[J]. Mol Med Rep，2016，13（6）：4800-4806.
[14] Jiang X，Hu C，Arnovitz S，et al. miR-22 has a potent anti-tumor role with therapeutic potential in acute myeloid leukemia[J]. Nat Commun，2016，26（7）：11452.
[15] Song SJ，Ito K，Ala U，et al. The oncogenic microRNA miR-22 targets the TET2 tumor suppressor to promote hematopoietic stem cell self-renewal and transformation[J].Cell Stem Cell，2013，13（1）：87-101.
[16] Baffa R，Fassan M，Volinia S，et al. MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets[J]. J Pathol，2009，219（2）：214-221.
[17] Azbutyte V，Fiedler J，Kneitz S，et al. MicroRNA-22 increases senescence and activates cardiac fibroblasts in the aging heart[J]. Age（Dordr），2013，35（3）：747-762.
[18] Xiong J，Du Q，Liang Z. Tumor-suppressive microRNA-22 inhibits the transcription of E-box-containing c-Myc target genes by silencing c-Myc binding protein[J]. Oncogene，2010，29（35）：4980-4988.
[19] Nouraee N，Mowla SJ，Calin GA. Tracking miRNAs footprints in tumor-microenvironment interactions：Insights and implications for targeted cancer therapy[J]. Genes Chromosomes Cancer，2015，54（6）：335-352.
[20] Tsuchiya N，Izumiya M，Ogata-Kawata H，et al. Tumor suppressor miR-22 determines p53-dependent cellular fate through post-transcriptional regulation of p21[J]. Cancer Res，2011，71（13）：4628-4639.
[21] Patel JB，Appaiah HN，Burnett RM，et al. Control of EVI-1 oncogene expression in metastatic breast cancer cells through microRNA miR-22[J]. Oncogene，2011，30（11）：1290-1301.
[22] Yamakuchi M，Yagi S，Ito T，et al. MicroRNA-22 regulates hypoxia signaling in colon cancer cells[J]. PLoS ONE，2011，6（5）：e20291.
（收稿日期：2016-04-27）