小肠坏死性结肠炎 重生鼠坏死性小肠结肠炎动物模型树立办法改善
刘斌 阎静江 李晓霞
[摘要] 意图 运用环境模仿实验设备树立一个更为标准及简便易行的重生儿坏死性小肠结肠炎动物模型造模办法。办法 75只重生24 h昆明小鼠随机分为5组，A1、A2和A3组选用人工喂食+缺氧复氧冷影响+LPS灌胃；B组单纯人工喂食，C组为正常对照组。饲喂72 h后处死小鼠，进行肠道安排病理学评分。 成果 处理组重生鼠肠道安排与单纯人工喂食组及正常对照组比较差异均有统计学含义（P<0.05），且实验成果重复性较好。 定论 运用环境模仿实验设备树立的NEC动物模型在病因学上契合NEC 的病理生理特点，并将动物模型造模设备标准化，改善了克己设备重复性较差的缺陷，更适用于研讨重生儿坏死性小肠结肠炎。
[关键词] 重生儿坏死性小肠结肠炎；肠道损害；动物模型；新办法
[中图分类号] R725.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）35-0022-04
[Abstract] Objective To establish a standard and simple method of the neonatal necrotizing enterocolitis（NEC） animal model by the environment simulation equipment. Methods Seventy-five newborn mice at age of 24 hours were randomLy divided into 5 groups. Group A1 group， A2 group and A3 group were given artificial feeding， discontinuities cold/hypoxia exposure and LPS gavage. Group B was only given artificial feeding. Group C was a control group. Mice were sacrificed after being fed for 84 hours. Intestinal histopathology was scored. Results There was statistically significant between group A1， group B and group C （P<0.05）. In addition， all the repeated tests were obtained a same result. Conclusion The NEC animal model established by environmental simulation experiment was coincidence of the character of pathophysiology for NEC and improved the poor repeatability disadvantage， which made the NEC model device more normalizes. Thus， the model was very suitable to research NEC.
[Key words] Neonatal necrotizing enterocolitis； Injury of intestine； Animal model； New method
坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一种具有潜在致死性的重生儿胃肠道急症，由于缺少有用防备医治办法，患儿逝世率较高，对重生儿存活率有着严峻影响，然后遭到临床医师和研讨人员的高度重视。近年来，由于小儿重症监护病房（PICU）的运用及医务人员归纳本质的进步，许多早产儿和低体重儿得以存活，NEC的发病率也随之有添加趋势[1-4]。因而，在NEC的研讨中迫切需要树立一种简便易行、既高效又标准的重生儿NEC 动物模型建模办法，以进一步根究该疾病的发病机制并进行有用的防备医治。由于现在国内外模型树立办法首要为克己实验器件，器件尚无统一标准[5-9]，故本研讨意图是以国内外研讨为根底，对建模器件及办法加以改善，树立一个标准且简单易行的重生儿NEC 动物模型造模办法，现报导如下。
1 资料与办法
1.1 实验动物分组
本次实验动物均购自山西医科大学，契合国标GB14922-94无特定病原体动物级质量标准。取用重生昆明小鼠75只，男女不限，体重约5～10 g。重生鼠出世24 h后即与母鼠别离，随机分红5组，处理组A1、A2和A3参阅多要素联合造模计划[10]，继续处理72 h，并别离由不同实验员对处理组A1、A2和A3组别离进行操作；处理组B选用单纯人工喂食，继续处理72 h；对照组C选用母鼠乳喂食作为正常对照。
其间，处理组A1、A2、A3和处理组B出世后即置入环境模仿实验设备中经过鼠乳代用品进行人工喂食；对照组C丈量体重并符号后回来各自母鼠旁，继续与母鼠同笼，鼠乳喂食。
实验进程中重生鼠如发作逝世或严峻实验意外（如外伤、逃逸等）则进行扫除，不计入实验成果。
1.2 首要试剂及仪器
脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），雀巢特别能恩早产/低出世体重配方奶粉，英脱利匹特脂肪乳注射液（C14-24），小儿复方氨基酸注射液（19AA-Ⅰ），BD 密闭式静脉留置针24G，环境模仿实验设备（专利号201110214221.5）。
1.3 造模办法
1.3.1 人工喂食 重生鼠置于环境模仿实验设备内进行人工喂食，制造人工代乳品（表1）[11]，选用留置针去芯软针头进行管饲。喂食前用脱脂棉球蘸生理盐水对重生鼠口腔及面部皮肤进行清洁。人工喂食所运用的留置针每次运用结束后即刻在活动水中清洗。清洁后运用75%医用酒精消毒，并密封保存。再次运用前运用灭菌生理盐水进行冲刷以去除外表附着的酒精。实验中运用的留置针每鼠一支，不重复运用。首日每次喂食量操控在不少于0.1 mL，今后每过24 h喂食量添加0.1 mL，每日喂食次数不少于8次，视重生鼠具体情况调整饲喂距离，夜间重生鼠活动性下降，饲喂距离可酌情延伸。
1.3.2 缺氧复氧冷影响 于实验情况的环境模仿实验设备内充入纯氮，箱内氧气浓度降至零后迅速将重生鼠由保育情况的环境模仿实验设备中转移至实验情况的环境模仿实验设备内，继续以1.5 L/min通入氮气，保持窒息 1 min后将提早4℃预冷处理的水袋放入环境模仿实验设备内，并将设备温度调至4℃，将重生鼠放置在水袋上进行低温处理，一起，继续以1.5 L/min流量通入氧气，操控氧浓度大于50%，影响10 min。处理后将重生鼠移回保育情况的环境模仿实验设备，每日影响3次。
1.3.3 LPS灌胃 LPS以10 g/kg稀释于0.1 mL灭菌水中，运用去芯留置针头经过口腔插管灌胃，每日1次，接连3 d。
1.4 标本收集
各组乳鼠每日守时称量体重，于造模开端后第72小时中止饲喂处死取标本。在小鼠腹部正中切开腹腔，别离肠血管及系膜。取回盲部及其远近端共5 cm肠管置入包埋盒进行白腊包埋，一切标本收集均在冰上完结。
1.5 肠安排病理学查看与评分
回盲部及其远近端共5 cm肠管白腊包埋后，作4～5 μm 接连切片，惯例HE 染色，选用随机数法对每个切片进行随机编号，观片人员选用盲法对每个标本进行肠道安排的病理学评分，病理学评分选用双盲法，评分标准参阅Nadler标准[12]。评分细则如下：0分：肠道安排结构正常，肠道上皮、绒毛完好；1分：黏膜下或固有层轻有微肿胀别离；2分：黏膜下和（或）固有层中度别离，黏膜下和（或）肌层水肿；3分：黏膜下和（或）固有层重度别离，黏膜下和（或）肌层水肿，部分绒毛掉落；4分：肠绒毛消失并伴有肠坏死等。评分≥2分者视为模型动物发作了NEC病理改动。
1.6 统计学剖析
数据剖析用SPSS11.5（SPSS公司，美国）软件在Windows XP环境下进行。计量数据资料运用中位数和四分位数距离M（Q）表明，多组间数据比较选用Kruskal-Wallis H 秩和查验法进行剖析，进一步依据均匀秩次进行两两比较，P<0.05为差异具有统计学含义。
2 成果
2.1 一般情况
处理组A1、A2、A3组重生鼠在实验开端后24 h内即呈现主动活动削减，对外界影响反响减缓乃至消失。一起伴有排黄绿色乃至黑色稀便等大便性状的改动。开端实验后处理组A1、A2、A3组和处理组B组重生鼠均呈现不同程度呈现腹胀和胃潴留的症状。对照组C组生长发育无显着反常，体重添加安稳，主动活动及对外界影响反响杰出，进食及排便正常，无消化道反常体现。
2.2 外观改动
处理组A1、A2、A3组和处理组B组肠道安排均与对照组比较有显着差异。处理组A1、A2和A3组肠道外观改动较为显着，回盲部近端大段肠管外观呈黑赤色，光泽度及弹性显着下降。处理组B 组可见回盲部近端肠管色彩呈黄赤色，部分肠管可见污黄色，光泽和弹性较正常安排有下降。此外，处理组A1、A2、A3组和处理组B组重生鼠肠腔内均有不同程度积气，少量重度者可呈串珠样，尚无肠穿孔症状呈现。对照组C组肠管色彩粉嫩，有光泽，弹性杰出，未见积气。
2.3 病理学改动
在处理组A1、A2、A3组重生鼠肠道安排病理可见显着坏死。镜下可见肠壁绒毛变性水肿，坏死、乃至掉落消失。肠壁内腺体摆放紊乱，乃至消失，肠道肌层不同程度变薄乃至部分开裂。重度固有层及黏膜基层水肿，伴有很多炎性细胞滋润，病理学评分均为 3～4 分（封三图1），与正常对照组重生鼠比较有统计学含义（P<0.05）。处理组B组重生鼠镜下可见中度绒毛充血水肿，腺体摆放紊乱，单个可见轻度的坏死，部分伴有中性粒细胞滋润，与处理组A1、A2、A3组重生鼠炎症程度差异有统计学含义（P<0.05），且与正常对照组C组重生鼠差异有统计学含义（P<0.05）。正常对照组C组重生鼠的肠道结构完好，未见显着病理学改动。见表2。
3 评论
小肠及结肠的广泛斑片状坏死是NEC的首要特征，一旦发作即可在短期内引发全身性败血症和多器官功用衰竭，进而导致逝世。迄今为止，NEC切当的病因及发病机制尚未被彻底阐明，现阶段的研讨仅提示：不妥人工喂食、早产及感染等是NEC发病的风险要素。近年来国内外很多研讨也显现：循环LPS浓度在NEC患者和NEC的动物模型中均呈升高趋势[13]；并且循环LPS浓度的添加可进一步损坏肠道上皮细胞[14]，并激活白细胞，开释很多炎性细胞因子[15]。归纳以上观念以为NEC的首要病理生理进程为：多种要素相互效果下导致的黏膜损害诱发患儿发作继发性免疫应对，进一步导致肠道黏膜内抗炎—促炎因子平衡的失衡，然后引起一系列肠道坏死性改动。
现在大部分NEC动物模型造模选用的都是克己实验配备，由于配备制造工艺和功用的约束，导致了NEC动物模型在造模进程中无法标准实验条件，其他实验室在进行重复实验时无法复原参阅文献中的造模条件，导致NEC动物模型造模实验条件实践上各不相同。特别是实验中无标准的重生动物保育办法，简单导致模型动物自身处于非保育情况，对实验成果发作搅扰，乃至呈现意外逝世。本研讨选用了环境模仿实验设备（专利号201110214221.5）代替大多数文献中运用的克己重生鼠保育设备，该设备优势在于能够经过显现器实时监控保育箱温度、湿度、氧浓度及气压等多项目标，并可经进程序主动调理气体排量，保持安稳气压，能够防止实验气体很多快速进入而形成的实验动物损害，经过负压排气设备合作内部空气循环设备能够在短时刻将气体彻底置换，且气密性较好，不易发作漏气或换气不全等情况，特别适合于重生动物保育及缺氧窒息等特别通气条件下的动物实验。本研讨中还将多要素联合造模实验分为3次进行，由不同实验人员在不一起间段进行，正式实验前需经过几回预实验使实验人员对人工喂食技能和环境模仿实验设备操作进行了解，削减由于操作陌生形成的实验动物意外损害，终究重复实验成果之间并无显着统计学差异（表2），证明运用环境实验模仿设备制造的NEC动物模型可重复性较强，有利于实验模型的推行和改善。
在本研讨前期预实验中发现，国内外文献遍及提及的缺氧窒息时刻为10 min乃至更长[10]，但实践运用环境模仿实验设备进行缺氧窒息2 min后动物逝世率就达100%，屡次重复实验均呈相似成果，因无法复原其他实验室克己保育设备难以具体剖析其实践原因，因而依据预实验成果将本研讨中缺氧窒息时刻调整为1 min，在确保尽可能削减实验动物意外逝世的前提下给予恰当的缺氧窒息。
在临床实践中，NEC 最常见的发病原因是早产儿喂食不妥和缺氧，感染等导致的，其间喂食不妥往往是最首要的致病原因，部分患儿出世后仅有喂食不妥史而无缺氧窒息和感染史，因而本实验将人工喂食作为单一条件进行造模，并与多要素联合造模进行比较，病理成果显现，人工喂食作为单一要素造模也会形成肠道损害，但与多要素联合造模成果比较肠道损害程度差异有统计学含义（P<0.05），多要素联合造模更挨近NEC发病的临床特征，更为科学合理。本研讨中单纯人工喂食的重生鼠病理评分为1（1）分[M（Q）]，肠道损害程度较轻，且未发作意外逝世及其他疾病体现，重生鼠活动性及外观情况挨近于鼠乳喂食重生鼠，阐明环境模仿实验设备保育功能较好，在非实验情况能够给予动物较为安稳的保育环境。
本研讨中运用环境模仿实验设备树立的NEC动物模型选用多要素联合造模办法，归纳了临床常见的风险要素包含：早产、产后窒息、肠道致病菌感染、不妥人工喂食、缺血再灌注损害等，契合NEC 的病理生理特点。本研讨中运用的环境模仿实验设备将NEC动物模型造模设备标准化，改善了克己设备重复性较差的缺陷，加强了非实验情况下的保育办法，更适用于重生儿坏死性小肠结肠炎的研讨。
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（收稿日期：2015-09-21）