孟鲁司特钠片儿童用量转录因子在孟鲁司特钠医治类固醇激素反抗型变应性鼻炎中的效果

点击：0时间：2025-12-09 09:02:21

任刚+++徐珏+++罗旭东+等

[摘要] 意图研讨外周血单个核细胞中转录因子活化蛋白-1（AP-1）及核因子-κB（NF-κB）在孟鲁司特钠医治类固醇激素反抗型变应性鼻炎（AR）中的效果。办法挑选50例类固醇激素反抗型AR患者，随机分红两组，别离口服孟鲁司特钠片（孟鲁司特钠组）或ATP片（安慰剂组）医治，医治21 d后，对两组患者进行症状和体征记分，使用EMSA法测定外周血中AP-1及NF-κB的DNA结合活性，ELISA法测定血清IL-4、IL-5及IL-10的表达水平。成果医治21 d后，孟鲁司特钠组医治有用率显着高于安慰剂组（P<0.01）；与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组AP-1和NF-κB的DNA结合活性显着下降（P<0.01）；孟鲁司特钠组症状与体征总积分下降指数（SRI）与AP-1及NF-κB的DNA结合活性呈负相关（P<0.05），而安慰剂组两者间无显着相关联系（P>0.05）；经医治后孟鲁司特钠组患者血清IL-4、IL-5水平较安慰剂组显着下降，而IL-10水平较安慰剂组显着升高（P<0.01）。定论孟鲁司特钠或许经过按捺外周血单个核细胞中转录因子AP-1及NF-κB的转录活性，调理细胞因子IL-4、IL-5及IL-10的表达，改进类固醇激素反抗型AR患者病况，发挥抗炎效果。

[关键词] 终年性变应性鼻炎；类固醇反抗；活化蛋白-1；核因子-κB；白介素-4；白介素-5；白介素-10

[中图分类号] R765.21 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）26-0041-05

虽然鼻用类固醇激素在变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的医治中起核心效果[1]，但是，在临床上有适当一部分AR患者吸入类固醇激素医治后并不能有用缓解临床症状，对类固醇医治无反响，从广义来说称之为类固醇激素反抗型AR[2]。类固醇激素反抗型病例的呈现已成为AR临床医治的难题，且长时间大剂量使用激平素导致一系列严峻的不良反响，因而，人们在不断寻觅新的有用药物来补偿激素医治的缺乏。很多研讨标明[3，4]，口服白三烯受体拮抗剂能有用改进AR及类固醇激素反抗型AR的症状及转归，但其详细效果机制尚不清楚。白三烯受体拮抗剂孟鲁司特能经过下降核转录因子活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的转录活性，影响细胞因子IL-4、IL-5及IL-10的表达，可作为激素反抗及激素依靠型哮喘患者的联合用药[5]。现在，国内外尚无AP-1和NF-κB及相关细胞因子在类固醇激素反抗型AR中表达及其含义的研讨报导，本研讨将选用孟鲁司特钠医治类固醇激素反抗型AR，调查其对AP-1和NF-κB转录活性及细胞因子IL-4、IL-5及IL-10的影响，深化知道白三烯受体拮抗剂在类固醇激素反抗型AR医治中的效果及其机制，然后为类固醇激素反抗型AR的医治供给理论依据。

1 材料与办法

1.1 临床材料

挑选2011年1月～2012年12月于我院门诊随访医治的类固醇反抗性AR患者（契合类固醇激素反抗型AR确诊规范[2]）共50例，男28例，女22例，年纪18～56岁，中位年纪26岁，其确诊及病况分级均契合2009年武夷山规范[6]。选用单纯随机法将当选目标随机分配入两组：孟鲁司特钠组（口服孟鲁司特钠片）25例，男13例，女12例，年纪18～56岁，中位年纪26岁；安慰剂组（口服ATP片）25例，男15例，女10例，年纪18～54岁，中位年纪26岁。两组研讨目标在年纪、性别、病程、临床症状记分、体征记分等方面差异无统计学含义（P>0.05）。一切患者签署道德委员会同意的知情同意书。归入规范：①年纪18～60岁；②契合类固醇反抗型AR的确诊规范[2]；③至少有3个鼻部症状（鼻痒、喷嚏、流涕或鼻塞）和体征记分在2分以上。扫除规范：①患有哮喘等其他变态反响性疾病；②患有其他呼吸道疾病、严峻的鼻中隔偏曲、鼻息肉及鼻窦炎；③妊娠或哺乳期妇女；④患有器质性心脏病以及肝、肾功用不全者；⑤恶性肿瘤和其他或许影响正确点评效果者；⑥在当选前3个月，部分和（或）全身接受过糖皮质激素及免疫按捺剂，3 d内使用过抗组胺药者。退出规范：①未能及时完结医治，医治依从性差，停药超越3 d，接连服药天数未到达3周：②用药1周以上，症状、体征加剧或不能有用缓解，导致无法坚持医治；③呈现不能耐受的副反响或严峻不良反响。退出病例将被计为无效病例并进行抢救性医治。

1.2 试验仪器及试剂

Model 550酶标仪、电泳槽及凝胶成像剖析系统购于美国Bio-Rad；DY-A型稳压电泳仪由我国西巴斯生物技术开发公司供给；SW41低温高速离心机由美国Beckman供给。淋巴细胞别离液由天津市灏洋生物制品科技有限责任公司供给；溶血素由美国Beckman-Coulter公司供给；破膜液均美国BD公司供给；孟鲁司特钠片购于美国默沙东公司；ATP片购于广州光华药业股份有限公司；核蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；电泳迁移率剖析试剂盒、Biotin 3′End DNA Labeling Kit购于美国Pierce公司；探针由上海生工生物工程有限公司组成；IL-4、IL-5及IL-10 ELISA试剂盒由法国DIACLON公司供给。

1.3 试验办法

1.3.1 研讨目标药物干涉与随访选用前瞻性随机对照法，将患者随机分为两组：孟鲁司特钠组——口服孟鲁司特钠片（每天1次，每次10 mg，阶段21 d）；安慰剂组——口服ATP片（每天1次，每次20 mg，阶段21 d）。患者需逐日记载其症状的改变，并于医治后的第7、14、21天进行随诊，问询用药依从性；症状与体征是否加剧，是否无法坚持医治；是否存在副效果及不良反响。按“AR诊治准则和引荐计划”[7]，对临床首要症状（喷嚏、清涕、鼻塞和鼻痒）和体征进行评分，依据医治前后症状记分与体征记分之和，核算总记分下降指数（score reduce index，SRI），SRI=（1-医治后总记分/医治前总记分）×100%，依据SRI点评医治效果，若SRI≤25%为医治无效，若SRI>26%为医治有用。endprint

1.3.2 标本的搜集与处理别离在入组当天及医治后第21天抽取患者空腹外周静脉血10 mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。取2 mL选用3000 r/min离心15 min后取血清，储存于-20℃冰箱中，用于检测血清中IL-4、IL-5及IL-10的浓度。另8 mL 制备PBMC悬液，用于检测核转录因子AP-1和NF-κB的转录活性。

1.3.3 电泳迁移率剖析法（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）测定AP-1和NF-κB的DNA结合活性（1）搜集单个核细胞，参加预冷的PBS，洗刷细胞2次，依照核蛋白提取试剂盒提取研讨目标PBMCs中的核蛋白，选用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，分装并保存于-80℃，防止重复冻融。（2）EMSA检测：①探针符号及功率检测：AP-1的探针序为5′-CGCTTGATG AGTCAGCCGGAA-3′、3′-GCGAACTACTCAGTCGGCCTT-5′；NF-κB的探针序列为：5′-AGTT GAGGGGACTTTCCCAGCC-3′、 3′-TCAACTCCCCTGAAAG GGTCCG-5′。运用Biotin 3′End DNA Labeling Kit进行3′末端符号。经90℃退火1 min，缓慢冷却，室温孵育30 min，组成双链，-20℃保存，并进行功率的检测。②核蛋白结合反响：5 μg核蛋白与结合缓冲液，2.5%甘油，5 mmol/L MgCl2，50 ng/μL poly（dI-dC），0.05%NP-40，50 nmol/L生物素符号的DNA探针室温孵育20 min。③非变性凝胶电泳：制备6%聚丙烯酰胺凝胶，上样，100 V，电泳1 h，4℃，恒流 380 mA，将凝胶上的蛋白转移至尼龙膜上。④紫外交联：将尼龙膜于254 nm紫外照耀10 min进行交联，以便DNA固定于尼龙膜上。⑤化学发光检测：将交联后的尼龙膜放在洁净培养皿中，参加20 mL LighShiftTM Blocking Buffer，封闭15 min，与辣根过氧化物酶符号的亲和素溶液（1∶300稀释）在摇床上孵育15 min，洗膜5 min/4次，然后用LighShiftTM底物平衡缓冲液平衡5 min，X胶片曝光后，惯例显影，定影。经核算机图画剖析仪扫描成像，测定对应条带的灰度值，核算转录因子DNA结合比活性。

1.3.4 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunoadsorbent assay，ELISA）测定血浆白介素含量别离按ELISA试剂盒操作阐明检测血清中IL-4、IL-5及IL-10的含量。

1.4 统计学处理

选用SPSS17.0 统计学软件进行数据处理。本研讨材料为小样本材料，计数材料选用四格表材料的Fisher切当概率法剖析，数据以n（%）标明；计量材料经查验呈非正态分布且方差不齐，运用Mann-Whitney U剖析，数据以M（QR）标明；双变量相关性使用Spearman秩相关剖析。P<0.05为差异有统计学含义。

2 成果

2.1 随访状况及临床效果

50例患者医治期间无掉落、退出和间断者。在医治过程中依从性较好，无因症状或体征加剧而导致不能坚持医治，未发现不能耐受的副反响或严峻不良反响。依据医治前后症状记分与体征记分之和核算SRI，点评医治效果。孟鲁司特钠组84.0%的患者对医治有用，而安慰剂组仅24%的患者对医治有用，差异有统计学含义（P<0.01）。

2.2 孟鲁司特钠对NF-κB和AP-1转录活性的影响

两组患者别离口服孟鲁司特钠片或ATP片医治21 d，抽取外周静脉血，经EMSA法检测AP-1和NF-κB的DNA结合活性。经过经Mann-Whitney U查验标明，与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组AP-1和NF-κB的DNA结合活性显着下降，差异有统计学含义（P<0.01）。

2.3 症状与体征总积分下降指数（SRI）与转录因子的DNA结合活性相关性

经过Spearman秩相关剖析发现，孟鲁司特钠组SRI与转录因子AP-1和NF-κB的DNA结合活性呈负相关（P<0.05），而安慰剂组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性间无显着相关性（P>0.05）。

2.4 孟鲁司特钠对血清IL-4、IL-5及IL-10含量的影响

两组患者别离口服孟鲁司特钠片或ATP片医治21 d，两组患者血清IL-4、IL-5含量均下降，IL-10含量显着升高，与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组患者血清IL-4、IL-5及IL-10含量改变愈加显着，差异有统计学含义（P<0.01）。

3 评论

类固醇激素是现在最有用的抗炎药物，广泛用于气道缓慢炎症疾病，包含变应性鼻炎、哮喘和缓慢阻塞性肺疾病的医治。类固醇激素效应发生的分子机制首要包含两方面：①与转位入核的糖皮质激素受体结合构成二聚体，与靶基因5′端发动子区的糖皮质激素反响元件衔接，调控靶基因的转录；②类固醇激素受体与AP-l和NF-κB等转录因子相互效果，搅扰作为炎症增强因子的AP-l和NF-κB诱导炎症基因转录的才能，下调细胞因子和炎症递质的表达，到达抗炎的成效[8]。跟着其临床使用的日益广泛，部分患者对类固醇激素的医治无反响，表现为类固醇激素反抗。事实上，许多疾病都存在类固醇反抗现象，如哮喘、淋巴细胞性白血病、缓慢鼻窦炎、溃疡性结肠炎等[9]。

引起类固醇激素反抗的机制反常杂乱，现在尚不彻底清晰，多种机制或许参加激素反抗，不同患者激素反抗的机制也不尽相同。如上述，激素的抗炎效果首要是经过按捺转录因子AP-1和NF-κB来完成，但是，过度表达的AP-1和NF-κB也可搅扰糖皮质激素受体的功用，按捺糖皮质激素抗炎效应的发生。激素反抗患者外周血细胞AP-1添加，过多的AP-1改变了GR与DNA结合的才能，使核内可以和GRE结合的有活性的GR数量削减，导致激素医治效果下降[10]。还有研讨发现GC反抗性哮喘患者T细胞和单核细胞中有c-fos转录添加c-fos组成添加或许是AP-1表达增多和糖皮质激素受体DNA结合才能下降的机制[11]。激素与受体结合后，经过招募HDAC2，能反转组蛋白的乙酰化，然后封闭激活的炎症基因。COPD患者吸烟等发生的氧化应激损伤了HDAC2的活性，使组蛋白乙酰化添加，NF-κB激活的炎症反响扩大，然后导致激素反抗[12]。已有体外试验研讨标明，白三烯受体拮抗剂孟鲁司特能有用下降激素反抗型及激素灵敏型哮喘患者PMMCs中AP-1及NF-κB的DNA结合活性，然后为激素反抗型患者的联合医治带来期望[5]。endprint

类固醇激素对白三烯的代谢无按捺效果，类固醇联合白三烯拮抗剂医治有相加或协同效果[13]，口服孟鲁司特钠医治对AR及类固醇激素反抗型AR转归、症状改进均有显着效果，标明白三烯受体拮抗剂医治AR是安全有用的，对类固醇反抗型和难治型AR均或许有利[3，4，13]。本研讨也标明，与安慰剂相比较，经孟鲁司特钠医治后，其症状记分及体征记分显着下降，标明孟鲁司特钠能有用改进类固醇激素反抗型AR患者的病况。

本研讨进一步选用EMSA法检测了两组患者转录因子AP-1和NF-κB的DNA结合活性，经过比较发现，孟鲁司特钠组AP-1及NF-κB的DNA结合活性较安慰剂组显着下降，这与于钦凤等[5]的研讨共同。武玉清等[14]研讨也发现，孟鲁司特可以按捺哮喘豚鼠气道淋巴细胞NF-κB的激活，促进其凋亡，然后削减气道淋巴细胞滋润，缓解哮喘气道炎症。孟鲁司特经过对NF-κB及MMP-9活性的按捺，然后按捺哮喘的气道重塑[15]。咱们的研讨进一步剖析经药物医治后，SRI与转录因子DNA结合活性之间的相关性，成果发现孟鲁司特钠组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性呈负相关，标明经孟鲁司特钠医治后，其核因子AP-1及NF-κB的DNA结合活性越低，症状与体征缓解越显着，而安慰剂组SRI与AP-1及NF-κB的DNA结合活性间无显着相关联系。

已有研讨标明，AR患者外周血IL-4及IL-5的表达显着高于健康人群[16]，而IL-10的水平显着低于健康人群[17]。IL-5、IL-4、IL-10和肿瘤坏死因子-α等炎性细胞因子的基因转录调理需求AP-1、NF-κB等转录因子的参加[2]。活化的AP-l作为一种转录因子结合到反响元件TRE，激活IL-4、IL-5和GM-CSF等在炎症反响中具有重要效果的多种因子的基因转录。活化的NF-κB参加细胞因子（如IL-2、IL-8、IL-l0、GM-CSF等）、黏附分子等免疫和炎症反响因子的表达，促进炎症、肿癌、凋亡等相关基因的转录。为清晰AP-1、NF-κB是否经过影响炎症因子的表达发挥抗炎效果，咱们选用了ELISA法剖析了两种研讨目标血清IL-4、IL-5及IL-10水平，成果发现，与安慰剂组比较，孟鲁司特钠组血清IL-4、IL-5显着下降，而IL-10的水平显着升高，与于钦凤等[5]的研讨共同。

综上所述，孟鲁司特钠或许经过对AP-1及NF-κB的转录活性的按捺，下调IL-4、IL-5的表达，上调IL-10的表达，改进类固醇激素反抗型AR患者的病况，到达医治效果，是类固醇激素反抗型AR联合医治有用合理的途径。

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（收稿日期：2013-12-03）endprint