防备妊娠期糖尿病 连接蛋白43 mRNA在妊娠期糖尿病胎盘安排中的表达及含义
付长霞++++++张春香++++++刘立昌++++++吕世军
[摘要] 意图 评论连接蛋白43（Connexin43， Cx43）mRNA在妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus， GDM）胎盘安排中的表达。 办法 收取GDM未医治组18例，GDM医治组22例，正常妊娠组12例， HE染色调查各组胎盘安排标本细胞滋补细胞、合体滋补细胞等的改动。使用RT-PCR办法检测Cx43 mRNA在三组胎盘安排中的表达。成果 安排学调查显现GDM未医治组的胎盘安排中细胞滋补细胞、合体滋补细胞显着多于GDM医治组及正常对照组。三组胎盘安排中均有Cx43 mRNA的表达，Cx43 mRNA在GDM未医治组较正常妊娠组和GDM医治组下降，具有计算学含义（P<0.05）。定论 Cx43 mRNA在GDM胎盘中的低表达是引起胎盘结构和功用改动的重要因素，在GDM的发病过程中起重要效果。
[关键词] 妊娠期糖尿病；胎盘；连接蛋白43；RT-PCR
[中图分类号] R714.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）10-0050-04
妊娠期糖尿病（gestational diaetes mellitus，GDM）是指妊娠期初次发作和发现的不同程度的糖代谢反常，包含妊娠前现已存在但被漏诊的孕前糖尿病者以及孕期随同发作的糖耐量反常者[1]，我国GDM发病率为1%～5%[2]。缝隙连接（gap junction， GJ）是由相邻细胞间两边质膜的连接子（Connexon）相连接构成的通道，每个连接子是由六个形状相同、功用一起的蛋白分子亚基，即连接蛋白（Connexin，Cx）环绕中心孔道摆放构成的亲水通道，是现在已知的细胞间直接进行物质交流的专一的膜通道结构。GJ和细胞缝隙连接通讯（gap junction intercellular communication，GJIC）能够调控细胞增殖、细胞凋亡，参加细胞的成长按捺和转化。连接蛋白43（Cx43）作为首要的连接蛋白，是现在人体散布最广的一个连接蛋白[3]。现在国内外文献中鲜有关于Cx43在GDM胎盘中表达状况的研讨报导。本文的研讨意图是调查Cx43 mRNA在GDM胎盘中的表达，评论Cx43 mRNA在GDM胎盘中的调控效果，为阐明Cx43在GDM发病中的效果机制供给理论基础。
1材料与办法
1.1一般材料
挑选2011年7月～2012年6月于潍坊市中医院产科住院临产的妇女，均扫除孕前有糖尿病病史。参阅2010年美国糖尿病学会（American Diabetes Association，ADA）的确诊规范[4]将患者分为三组，GDM未医治组18例； GDM医治组22例；同期临产的正常妊娠妇女共12例作为对照组，三组孕妈妈年纪、临产孕周比较，差异无计算学含义（P>0.05）。三组孕妈妈均无烟酒嗜好，既往无高血压、血液病、肾脏疾病、代谢性疾病等病史。
1.2研讨办法
1.2.1标本收集 三组孕妈妈均于胎盘娩出后胎盘称重，直视下选取胎盘母面中心带与中心带安排（避开钙化、机化灶），将其分为两部分：一部分切成约2.0 cm ×2.0 cm ×0.5 cm小块安排，用4%福尔马林固定，做白腊切片；另一部分切成约0.5 cm3的小块，置于DEPC处理过的冻存管中，符号后放入-70℃冰箱低温保存备用。
1.2.2 安排蜡块的制造及HE染色 固定，洗刷，脱水，通明，浸蜡，包埋，白腊切片惯例脱蜡入水，水洗，苏木素染色，伊红染色，脱水通明，中性树胶封片，显微镜调查染色成果。
1.2.3胎盘安排Cx43 mRNA 表达水平的检测 ①总RNA 的别离 选用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，提取胎盘安排总RNA。②逆转录聚合酶链反响（RT-PCR） ：选用M-MLV榜首链cDNA组成试剂盒，依据文献规划Cx43 RT-PCR引物：上游：5'-ATGAGCAGTCTGCCTTTCGT-3'；下流：5'-TCTGCTTCAAGTGCATGTCC-3'；扩增产品长度为249 bp。RT-PCR 在50 μL 反响体系中进行，按37℃ 60 min进行逆转录，94℃ 4 min灭活逆转录酶和PCR 预变性， 94℃15 s、58 ℃30 s和72℃90 s完结40个循环的PCR。③PCR琼脂糖凝胶电泳并剖析：PCR反响完毕后，参加1%的琼脂糖凝胶样品孔中在100V恒压下进行15 min电泳；电泳完毕后取出凝胶，于BiospectrumAC 凝胶成像剖析体系下照相并扫描剖析测定荧光密度读数值。
1.3 成果判别
1.3.1 HE染色成果断定 三组标本中，每张切片在高倍（400×）视界下随机选取不重复的100个终末绒毛，共调查终末绒毛5200个，调查细胞滋补细胞、合体滋补细胞数量。
1.3.2 胎盘安排Cx43基因的RT-PCR 成果断定 使用RT-PCR法从正常妊娠老练胎盘和GDM胎盘安排中成功提取总RNA，然后以总RNA为模板成功扩增出Cx43意图基因，产品长度约为249 bp，成果显现在三组胎盘安排中均有Cx43 mRNA的表达，内参照β-actin的意图基因产品长度约为116 bp，电泳成果通过BiospectrumAC凝胶图画扫描仪对DNA电泳条带作光密度剖析，用均数±规范差（x±s）表明。
1.4 计算学剖析
运用SAS8.0计算软件进行数据处理和剖析。计数材料选用根据二项散布的两样本率查验，计量材料选用方差剖析，两两比较选用SNK-q查验，P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 HE染色
三组标本中调查终末绒毛中合体滋补细胞和细胞滋补细胞阳性率及比较成果见表1。GDM未医治组与GDM医治组、GDM未医治组与正常对照组比较，差异有计算学含义（P 均<0.05）。GDM医治组与正常对照组比较，差异无计算学含义（P>0.05）。endprint
正常妊娠组：绒毛巨细均匀，散布及形状规矩，绒毛滋补细胞单层散布，合体滋补细胞和细胞滋补细胞罕见，见图1。GDM医治组：光镜下见老练绒毛居多，合体滋补细胞和细胞滋补细胞罕见，见图2。GDM未医治组：镜下见末梢绒毛有的老练，也有不老练的区域。绒毛滋补细胞单层散布，合体滋补细胞显着增多，细胞滋补细胞增多，见图3。
表1 三组胎盘安排各目标阳性率间比较（二项散布正态近似法）
2.2 胎盘安排Cx43基因的RT-PCR
通过BiospectrumAC凝胶图画扫描仪对DNA电泳条带作光密度剖析（电泳成果见图4），用均数±规范差（x±s）表明，经方差齐性查验，各组整体方差齐，经单因素方差剖析，各组间差异具有计算学含义（P<0.05），见表2。然后用SNK-q查验进行两两比较，GDM未医治组别离与正常妊娠组和GDM医治组比较，其Cx43 mRNA均显着下降，差异具有计算学含义（P<0.05）。成果阐明与正常妊娠组和GDM医治组比较，GDM胎盘未医治组Cx43 mRNA的表达量显着削减。
3 评论
GDM发病机制比较复杂，国内外许多学者从不同方面临其发病机制进行评论，但到现在为止仍无清晰的定论。胎盘是介于母体-胎儿之间的一个重要的暂时性器官，具有物质交流、代谢、排泄激素、防护以及组成等功用，其结构和功用的完整性对保持妊娠有重要效果。本文安排学调查发现GDM未医治组胎盘比GDM医治组和正常妊娠组胎盘的合体滋补细胞和细胞滋补细胞增多、胎盘内未老练绒毛或水肿绒毛间质内haufbauer细胞增多等，体现胎盘绒毛发育不老练与从前报导一起[5，6]。
胚胎发育前期，细胞缝隙连接蛋白就开端表达，且这种表达受时空调理，一种缝隙连接蛋白表达的一起，另一种连接蛋白的表达或许正在封闭，这种现象在胚胎发育中很常见。出世后每种安排表达的缝隙连接蛋白的品种和数量根本安稳不变。缝隙连接的首要功用是介导细胞间的电偶联，传递动作电位，保持机体的电活动和机械缩短，确保活动的同步性；交流细胞间离子、营养物质、液体、保持细胞稳态；调控细胞的成长和分化；在胚胎的构成、成长和发育中调理细胞间信号的传递；环核苷酸、钙离子、磷酸肌醇等第二信使能够从已被激素激活的细胞通过缝隙连接进入并激活停止细胞，然后进步安排对激素的应对。
本文研讨发现，Cx43 mRNA在GDM胎盘中的表达较正常妊娠胎盘显着削减。这或许是因为Cx43在转录前就存在缺点。本文估测引起Cx43 mRNA低表达的原因或许是：①细胞中Cx43基因发动区的CpG岛甲基化。连接蛋白表达反常的首要原因是表遗传改动，连接蛋白基因发动区的CpG岛甲基化是连接蛋白表达下调的首要原因。因在Cx43表达丰厚的正常安排中Cx43基因不存在甲基化，基因过度甲基化特别坐落发动子区域，是安排特异性基因表达缺失的一种一起机制，Cx43基因甲基化使Cx43基因反常表达，可使其在肿瘤细胞中失活，而表达削减乃至缺失。用去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶出来Cx43阴性的宫颈癌Hela细胞，发现Cx43从头表达[7]。但甲基化按捺连接蛋白基因转录并不是仅有的原因，其他原因还未清晰。②连接蛋白的基因突变：连接蛋白的表达能够按捺或诱导一些与成长有关的因子表达，如FGFR3、Her-2、IGF-1、P21、P27、IGFBP-4等。别的连接蛋白表达对一些分化相关因子的表达有影响。连接蛋白之所以会调控这些因子的表达，或许与这些因子的基因上存在连接蛋白反响元件（connexin reponse element，CxRE）有关[8]。连接蛋白自身反常影响了细胞的正常增殖分化。
胎盘安排中的细胞滋补细胞具有类似于肿瘤细胞的增殖特性。Cronier 等[9]用反义核苷酸技能证明了 Cx43在人滋补细胞的细胞-细胞通讯、滋补细胞交融和分化过程中起着重要效果。Dunk等[10]用试验证明Cx43缝隙连接斑块在交融细胞滋补层表达，Cx43介导的GJIC在滋补层细胞交融过程中发挥重要的功用效果。Malassiné等[11]从人胎盘别离出滋补细胞进行体外培育，鉴别出不同的膜蛋白直接参加滋补层细胞交融：Cx43、ZO-1和Syncytins。本文研讨发现Cx43 mRNA在GDM胎盘中低表达，或许直接导致细胞滋补细胞GJIC的结构和功用反常，细胞失掉广泛的信号通讯，躲避正常的成长操控，终究导致细胞滋补细胞和合体滋补细胞的增多。胎盘合体滋补细胞是完成很多胎盘功用的场所，包含物质交流、推陈出新和组成类固醇和肽类激素，这些激素是胎儿成长发育所必需的。妊娠时胎盘可发生雌激素、孕酮、催乳素和胎盘成长激素等多种对立胰岛素的激素，还能排泄胰岛素酶，加快胰岛素的分化。所以Cx43 mRNA在GDM胎盘中低表达，将会导致胎盘结构和功用反常，对立胰岛素激素排泄增多，而且加快胰岛素分化，这也是导致GDM的发病机制之一。
本试验显现GDM医治组和正常妊娠胎盘中Cx43 mRNA表达无差异，然后得出GDM患者通过前期饮食操控、体育锻炼或是胰岛素医治等，能够改进Cx43在其胎盘中的表达，阐明进步前期诊治对GDM开展的重要性。
[参阅文献]
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（收稿日期：2014-01-06）endprint
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