石墨烯量子点毒性 MTT法检测氧化石墨烯的细胞毒性

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关淑英+武峰+赵彬

[摘要] 意图研讨丝素-氧化石墨烯复合膜（SF-GO）的细胞毒性。办法选用MTT比色法检测含有不同浓度氧化石墨烯（0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%）制成的丝素-氧化石墨烯复合膜在不同时期（1 d、3 d、5 d、7 d）对小鼠成纤维细胞L929 细胞相对增殖率（RGR）的影响；经过透射电镜调查各组细胞的形状，终究点评丝素-氧化石墨烯复合膜的细胞毒性。成果跟着氧化石墨烯浓度的添加，细胞毒性在不断添加（P﹤0.01）；跟着测定天数的添加，氧化石墨烯的细胞毒性虽减小，但无统计学含义，且各组整体趋势均在减小；经过透射电镜相片可见各组细胞形状根本正常，细胞成长杰出，为长梭形或卵圆形，并可见圆形分裂细胞，细胞折光性强。定论氧化石墨烯浓度≤1wt%时无显着细胞毒性。

[关键词] 氧化石墨烯；细胞毒性；MTT法

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）17-0018-03

MTT assay for cetection of the cytotoxicity of graphene oxide

GUAN Shuying WU Feng ZHAO Bin

Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To study the cytotoxicity of silk fibroin-graphene oxide composite film（SF-GO）. Methods MTT assay was applied to test the impact of silk fibroin-graphene oxide composite film containing different graphene oxide concentrations（0.1 wt%， 0.2 wt%， 0.5 wt%， 1.0 wt%） at different periods（1d， 3d， 5d， 7d） on the relative growth rate （RGR） of rat fibroblast L929， and transmission electron microscope was applied to observe cell shape in different groups. The cytotoxicity of silk fibroin-graphene oxide composite film was evaluated. Results The cytotoxicity kept increasing with increase of graphene oxide concentration（P<0.01）. With days passing by， the cytotoxicity of graphene oxide gradually decreased without statistical significance， but the overall trend of decreased cytotoxicity was observed in all groups. Transmission electron microscope demonstrated that all groups had normal cell shape and good cell growth with spindle or oval shapes. Circular splinter cells were observed with strong cellular refractivity. Conclusion There is no obvious cytotoxicity with graphene oxide concentration≤1 wt%.

[Key words] Graphene oxide； Cytotoxicity； MTT assay

牙列残缺或牙列缺失是口腔修正中最常见的疾病，现在医治牙列残缺、缺失的最佳办法为栽培修正，但栽培体植入后需求等候骨愈合的时刻较长，期间会影响患者的咀嚼、说话功用，因而许多患者不愿意进行栽培修正，然后影响了栽培修正技能在临床中的使用。因而怎么缩短栽培骨植入后的愈合期成为当时栽培范畴的一大热门。辛伐他汀（simvastatin）是3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，近年来研讨指出：辛伐他汀不只能够有用下降胆固醇和低密度脂蛋白[1]，还或许促进松质骨的骨量添加，削减骨折发作[2]。但是，他汀类药物首要效果部位是肝细胞，在其他安排中的散布浓度十分低，要使他汀类药物对骨安排发挥有用效果则需求对骨安排部分用药，需求参加一种缓释剂使辛伐他汀小量而接连缓慢定量开释，以到达促进骨构成的效果。近年来，石墨烯衍生物成为纳米生物医学范畴研讨的热门[3，4]。氧化石墨烯为石墨烯衍生物。很多研讨标明，氧化石墨烯没有显着的细胞毒性，且涣散功能好，是一种功能优秀的药物载体，并且是一种杰出的药物缓释剂。丝素蛋白是蚕丝的主体，研讨标明[5]它具有杰出的生物相容性、无毒、无污染、无刺激性、可生物降解，常被用于细胞培育的基质和安排工程。

1 资料与办法

1.1 资料与仪器

小鼠成纤维细胞（L-929，中科院上海细胞资源中心）；四甲基偶氮唑盐（M TT，Sigma，美国）；重生小牛血清（杭州四季青有限公司）；丝素蛋白（SF，美国）；氧化石墨烯（GO，美国）；PBS缓释液（自配）；二甲基亚砜（Sigma，美国）；0.25% 胰酶（Hyclone，美国）； JEOLJEM-1200EX透射电镜（日本电子）；CARY100紫外可见吸收光谱仪（瓦里安，美国）；DNM-9602酶标分析仪（北京普朗新技能有限公司）；倒置相差显微镜（OLYMPUS）；超净台、 CQ50 超声波清洗器等。

1.2办法与过程

1.2.1 PBS溶液的制造NaCl 8 g， KCl 0.2 g， Na2HPO4 1.56 g， KH2PO4 0.2 g，加蒸馏水1000 mL。

1.2.2 MTT试剂的制造将粉状 MTT 以 5 g/L的浓度溶于制造的100 mL PBS 溶液，抽滤灭菌。

1.2.3丝素-氧化石墨烯复合膜（SF-GO）的制备先将氧化石墨烯在真空枯燥箱中枯燥24 h，称取必定量的氧化石墨烯涣散在二次水中，超声1 h，得到氧化石墨烯涣散液，别离取出必定量的涣散液参加到5个锥形瓶中，加二次水至10 mL，参加50 μL的冰醋酸，称取100 mg丝素蛋白5份，参加锥形瓶中，拌和混合，将混合液倒入6孔板中，超声15 min脱气泡，50℃烘干48 h，得到氧化石墨烯添加量为0 wt%、0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%丝素-氧化石墨烯复合膜。

1.2.4 测定资料的细胞相对增殖率将制作好的不同浓度的丝素-氧化石墨烯复合膜剪成直径为1 cm的小圆片，放入24孔板，各4孔，共接种4块板，每个孔别离参加1 mL的PBS液，将0 wt%浓度组设为对照组，15 min后将一切孔中PBS液吸出。将浓度为2.5×107个细胞/L的小鼠成纤维细胞 L929细胞悬液接种于放有不同浓度丝素-氧化石墨烯复合膜（SF-GO）的24孔培育板，每孔 1 mL，然后置于37℃、5% CO2培育箱中敞开培育 1、3、5、7 d后别离吸去培育液，倒置显微镜下调查细胞形状，再参加5 g/L的 MTT液 0.1 mL，持续在37℃培育4 h，吸弃原培育液，每孔参加2 mL PBS当心清洗 2 次；弃除余液，立即在各孔中参加二甲基亚砜1 mL，室温放置并细微振动20 min使结晶物充沛溶解；然后用酶联免疫检测仪测定其吸光度值（A），取均匀值（波长为490 nm），并将吸光度值（A1）转换成胞相对增值率（RGR），然后将各组的RGR转换成细胞毒性等级。细胞毒性试验[6]选用5分制法进行细胞毒性分级。RGR（%） = 试验组均匀OD值×100%/对照组均匀OD值。细胞相对增殖率与细胞毒性的分级的联系：RGR（%）≥100%细胞毒性为0级；RGR（%）为75%～99%，细胞毒性为1级；RGR（%）为50%～74%，细胞毒性为2级；RGR（%）为25%～49%，细胞毒性为3级；RGR（%）为1%～24%，细胞毒性为4级；RGR（%）为0%时，细胞毒性为5级。0级和1级被以为没有细胞毒性，2级为轻度细胞毒性，3级和4级为中度细胞毒性，5级为显着细胞毒性。

1.3 统计学处理

试验中OD值用均数±标准差标明，增值率用百分数标明，经过SPSS17.0 软件包进行统计学处理，相应的各组间比较选用LSD-t查验，P<0.05差异有统计学含义。

2 成果

2.1细胞毒性点评

2.1.1细胞形状调查透射电镜相片可见各组细胞形状正常，细胞成长杰出，为长梭形或卵圆形，并可见圆形分裂细胞，细胞折光性强，标明氧化石墨烯浓度≤1wt%时无显着细胞毒性，见图1。

图1 各组培育1 d后细胞形状（×500）

2.1.2 各组细胞OD值、细胞增殖率及细胞毒性见表1。由表1能够看出，跟着氧化石墨烯浓度的添加细胞增殖率在不断下降，细胞毒性在添加，各组差异有统计学含义（P﹤0.05）。跟着丈量天数的添加，细胞增殖率在不断添加，细胞毒性在减小，各组差异无统计学含义（P>0.05）。氧化石墨烯浓度为0.1 wt%组在第7天，细胞添加非但未受抑制，反而添加。

3 评论

2004年，英国Manchester大学Geim等经过尽力成功制备了世界上最薄的新式二维纳米资料-石墨烯 [7]，其厚度仅为0.35 nm[8]。石墨烯具有较好的电学、力学和热学等功能[9]，使其在很多范畴具有重要的使用远景[10]，成为近年来纳米范畴研讨的热门。但在生物医学范畴其衍生物氧化石墨烯使用较多，它是用石墨经氧化、超声制备而来。近年来研讨标明，氧化石墨烯没有显着的细胞毒性且涣散功能好，能够作为一种功能优秀的药物载体，并且是一种杰出的药物缓释剂。

该试验选用MTT比色法也叫四甲基偶氮唑蓝比色法[11]，其根本原理为MTT的环能够被存在于活细胞中坐落细胞色素b和细胞色素c位点的细胞线粒体琥珀酸脱氢酶裂解，然后将淡黄色的MTT催化还原为蓝色难溶性的结晶物堆积在细胞内，经过结晶物色彩的深浅反映结晶物的多少，然后反映细胞的多少及细胞推陈出新活性的强弱。该比色法操作简洁、灵敏度高且能够定量点评，现在被广泛使用于体外细胞毒性的点评。本试验经过比较小鼠成纤维细胞L929 细胞在氧化石墨烯浓度为0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%的丝素-氧化石墨烯复合膜在不同时刻段的增殖率来点评氧化石墨烯的细胞毒性。成果显现，细胞毒性与氧化石墨烯的浓度呈正相关，因丝素自身不具有细胞毒性，所以细胞毒性来自氧化石墨烯且具有浓度依赖性；跟着丈量天数的添加，细胞毒性在减小，虽各组在1、3、5、7 d差异无统计学含义，但各组细胞毒性整体趋势在减小，其原由于跟着时刻的延伸，氧化石墨烯的开释量在削减。经过表1可知，除氧化石墨烯浓度为1.0 wt%时在1、3 d细胞毒性为2外，其他各组细胞毒性为0、1，标明浓度为0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%的氧化石墨烯无细胞毒性，并且氧化石墨烯浓度为0.1wt%组在第7天，细胞添加非但未受抑制，反而添加。浓度为1.0 wt%的氧化石墨烯有轻度细胞毒性。经过电镜图片能够发现各组细胞形状根本正常，细胞成长杰出，遮光性强，阐明细胞毒性小。石墨烯发生细胞毒性的机制：①石墨烯特别结构导致其在细胞膜上的集合、堆积表现出必定的毒性。②细胞毒性效果还包含受caspase 3介导的细胞凋亡机制。③细胞毒性效果还来自氧化应激机制即自由基损害。现在作为药物载体，氧化石墨烯的使用首要会集在小分子药物输运方面[12]，有或许进一步推行到基因和蛋白药物的输运、医治方面，在其他方面的作业还比较少，有待于更进一步的研讨。

综上所述，低浓度的氧化石墨烯无显着细胞毒性，因而，氧化石墨烯能够用于口腔修正的医治中。

[参考文献]

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（收稿日期：2014-04-08）