什么卷烟吐出来烟雾多 卷烟烟雾提取物对小鼠C2C12细胞myostatin及炎症介质的影响
李玉姬 周煦 裴兴华 黄鹂 雷衍军 张璐璐
[摘要]意图 探討卷烟烟雾提取物（CSE）对小鼠C2C12细胞肌肉成长按捺素（myostatin）及炎症介质的影响。办法 不同浓度CSE和（或）myostatin-siRNA影响和（或）搅扰小鼠C2C12细胞后运用MTT检测CSE对细胞成长的影响，根据处理方式不同，试验分为4个组，别离为对照组、5% CSE组、myostatin-siRNA组、5% CSE+myostatin-siRNA组，选用Real-time PCR检测myostatin mRNA表达情况，选用Western blot检测myostatin蛋白表达情况，选用ELISA检测细胞培育液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素8（IL-8）含量。成果 5%以上的CSE处理能显着按捺小鼠C2C12细胞增殖（P<0.05）；5%的CSE处理小鼠C2C12细胞48 h后，myostatin mRNA和蛋白表达显着高于对照组（P<0.05），细胞培育液中IL-8和TNF-α含量显着高于对照组（P<0.05）；siRNA搅扰myostatin后再选用CSE处理小鼠C2C12细胞，细胞培育液中IL-8和TNF-α含量显着低于CSE处理组（P<0.05）。定论 CSE上调小鼠C2C12细胞myostatin表达，添加炎症介质开释。
[关键词]缓慢阻塞性肺疾病；卷烟烟雾提取物；肌肉成长按捺素；炎症介质
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）2（b）-0004-04
Influence of cigarette smoke extract on myostatin and inflammatory mediators in mouse C2C12 cells
LI Yu-ji ZHOU Xu PEI Xing-hua HUANG Li LEI Yan-jun ZHANG Lu-lu
The First Department of Critical Care Medicine，Peopel′s Hospital of Hu′nan Province，Changsha 410005，China
[Abstract]Objective To investigate the effect of cigarette smoke extract on myostatin and inflammatory mediators in mouse C2C12 cells.Methods Different concentrations of CSE and/or myostatin-siRNA stimulated or interference mouse C2C12 cells，and then detected influence of CSE on cell growth by MTT，according to the different treatment methods，the experimental research objects were divided into the control group，5% CSE group，the myostatin-siRNA group，5% CSE+myostatin-siRNA group.Real-time PCR was used to detect the expression of myostatin mRNA，Western blot was used to detect expression of myostatin protein，ELISA was used to detected tumor necrosis factor alpha （TNF-alpha） and interleukin 8 （IL-8） level in cell culture medium.Results The CSE at the concentration above 5% could significantly inhibit the proliferation of C2C12 cells in mice （P<0.05）.The expression of myostatin mRNA and protein in C2C12 cells treated with 5% CSE was significantly higher than that of the control group after 48 h （P<0.05）.The content of IL-8 and TNF-alpha in the cell culture fluid was significantly higher than that in the control group （P<0.05）.After siRNA interfered with myostatin，the mouse C2C12 cells were treated with CSE，the content of IL-8 and TNF-alpha in cell culture solution was significantly lower than that in CSE treatment group （P<0.05）.Conclusion CSE can up-regulate the expression of myostatin and increase inflammatory mediators releasing from C2C12 cells.
[Key words]Chronic obstructive pulmonary disease；Cigarette smoke extract；Myostatin；Inflammatory mediator
缓慢阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以进行性气流受限为特色的炎症反响性疾病[1]。吸烟是导致COPD发作的重要要素，卷烟烟雾成分能影响活性氧显着添加并诱导炎症反响[2]。除了肺部反常外，骨骼肌萎缩是最常见的肺外安排改动[3]。前期研讨显现，COPD大鼠肌肉成长按捺素（myostatin）含量显着添加，可以促进肌肉萎缩，而骨骼肌萎缩的发作或许与COPD肺部炎症及全身性炎症反响有关[4]。笔者估测卷烟烟雾成分升高骨骼肌细胞myostatin含量，引起炎症反响，导致骨骼肌萎缩和功用障碍。本研讨选用卷烟烟雾处理小鼠C2C12成肌细胞，查询myostatin表达和炎症反响情况，并评论myostatin在骨骼肌炎症反响中的效果，为COPD骨骼肌萎缩的防治供给新的思路和试验根据，现报导如下。
1材料与办法
1.1材料
小鼠成肌细胞C2C12细胞（中科院上海细胞库），芙蓉牌卷烟（焦油12 mg/支）（湖南中烟工业有限责任公司），DMEM培育基和胎牛血清（Gibco），MTT试剂（Sigma），Lipofectamine 3000和TRIzol（Invitrogen），逆转录试剂盒和Real-time PCR检测试剂盒（Takara），BCA蛋白定量试剂盒（WellBiology），ECL发光液（Pierce），兔抗myostatin多克隆抗体（Proteintech），GAPDH抗体、IL-8和TNF-α ELISA试剂盒（博士德），myostatin siRNA（GCGGATGGCAAGCCCAAATT，吉玛生物）。
1.2办法
1.2.1卷烟烟雾提取物制备 参照文献办法并加以改进[5]。将1支芙蓉牌卷烟去滤嘴焚烧5 min的烟雾经过注射器接连抽吸溶于10 ml 37℃预热的DMEM中，过滤除菌后作为100%的CSE原液，别离装备1.0%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE工作液，1 h内用于试验。
1.2.2 MTT检测 以5000个细胞/孔接种于96孔板，别离给予0.1%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE处理48 h，每组6个复孔，按照MTT说明书进行操作，检测不同浓度CSE处理后C2C12细胞成长情况。
1.2.3细胞干涉和分组 以105个细胞/孔接种于24孔板，试验分为4个组，别离为对照组、5% CSE组、myostatin-siRNA组、5% CSE+myostatin-siRNA组。处理48 h，每组6个复孔，搜集细胞上清用于ELISA剖析，搜集细胞用于mRNA或蛋白表达剖析。
1.2.4 Real-time PCR检测 C2C12细胞按照TRIzol法提取总RNA，按照试剂盒操作逆转成cDNA。运用ABI7500实时荧光定量PCR进行PCR扩增，引物序列见表1。反响系统20 μl，扩增条件为95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40个循环。按照2-ΔΔCT法[6]核算各组myostatin的相对表达量。
1.2.5 Western blot檢测 C2C12细胞按照RIPA裂解法提取总蛋白，BCA试剂盒定量后取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉关闭1 h，别离以myostatin抗体（1∶1000）和GAPDH抗体（1∶1000）孵育过夜后，二抗（1∶5000）孵育1 h，ECL化学发光显影。
1.2.6 ELISA检测 C2C12细胞上清搜集后，经过ELISA办法测定IL-8和TNF-α含量，具体操作过程按照试剂盒说明书进行。
1.3统计学处理
选用SPSS 20.0统计学软件对数据进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）表明，选用t查验，多组间比较选用单要素方差剖析（One-way ANOVA），两两比较选用最小显着性差异法（LSD），以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1不同浓度CSE对小鼠C2C12细胞增殖的影响
CSE处理小鼠C2C12细胞48 h，与对照组吸光值1.21±0.13比较，1.0%和2.5% CSE组均匀吸光度值为1.15±0.09和1.11±0.15，无显着变化，细胞增殖无显着影响（P>0.05）；5%和10% CSE均匀吸光度均为0.92±0.17，显着下降，细胞增殖被显着按捺（P<0.05）（图1）。后续试验选用5% CSE进行处理。
2.2各组细胞myostatin mRNA的表达水平剖析
Real-time PCR检测成果显现，5% CSE组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为1.32±0.15，显着高于对照组的1.00（P<0.05）；myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为0.61±0.19，低于对照组（P<0.05）；5% CSE+myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为0.92±0.13，低于5% CSE组（P<0.05）（图2）。
2.3各组细胞myostatin 蛋白的表达水平剖析
Western blot检测成果显现，5% CSE组的C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为1.40±0.11，显着高于对照组的1.00（P<0.05），myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为0.52±0.17，低于对照组（P<0.05），5% CSE+myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为0.93±0.15，低于5% CSE组（P<0.05）（图3）。
2.4各组细胞炎症介质表达水平
ELISA检测成果显现，5% CSE组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量别离为835.83±47.30和218.83±27.09，显着高于对照组（P<0.05）；myostatin-siRNA组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量别离为510.17±49.15和110.67±12.60，与对照组比较差异无统计学含义（P<0.05）；5% CSE+myostatin-siRNA组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量别离为709.83±111.75与162.17±23.52，低于5% CSE组（P<0.05）（图4）。
3评论
现在，COPD已经成为全球第四大致死性疾病，每年受COPD困扰的患者多达6亿。全球30岁以上人群中，COPD的患病率从1990年的10.7%上升到2010年的11.7%[7]。2013年全球疾病担负（GBD 2013）陈述指出，COPD导致的逝世人数从1990年的242.13万上升至2013年的293.12万，约占全球逝世人数的6%，成为全球第三大致死性疾病[8]。在发达国家，COPD是添加最为敏捷的死因之一，在心脑血管疾病病死率大幅下降的一起，COPD的逝世率却添加了163%[9]。跟着发展我国家吸烟率的添加和高收入国家的老龄化，COPD的发病率估计在未来30年内将上升，估计到2030年将有超越450万人死于COPD和相关疾病，逝世人数将挨近全球逝世总数的8.5%，成为全球第3位死因疾病。近年来，我国COPD发病率呈上升趋势。《我国居民养分与缓慢病情况陈述（2015年）》指出，我国40岁及以上人群中COPD患病率为9.9%。张荣葆等[10]针对我国已宣布的19项COPD大型流行病学查询材料（2000年1月～2011年12月）剖析后，发现我国各地40岁以上人群COPD患病率为6.0%～15.4%。
吸烟是COPD发作、发展过程中最重要的风险要素，卷烟烟雾成分能导致肺部甚至全身反常的炎症反响，引起肺癌安排如骨骼肌、心血管等病变，加剧COPD的发展[11]。骨骼肌是COPD劳累最首要的肺外安排，研讨显现，吸烟能导致蛋白组成削减和降解增多，然后导致骨骼肌耗费[12]。此外，卷烟烟雾成分能使肺部发作过多的炎症介质（如IL-8和TNF-α）并开释到循环中，参加骨骼肌萎缩的发作[13]。在骨骼肌的耗费及功用障碍过程中，肌肉成长按捺素遭到广泛重视，其首要效果为按捺肌肉的成长发育，在肌肉耗费性疾病中表达增高[14]。前期研讨已证明，COPD大鼠myostatin含量显着添加，而其在骨骼肌炎症中的效果怎么尚未查见相关文献报导。
本研讨成果显现，CSE处理小鼠成肌细胞C2C12后细胞myostatin表达添加，炎症介质开释增多；而用myostatin-siRNA缄默沉静myostatin基因后再用CSE处理细胞，myostatin表达添加程度遭到按捺，炎症介质开释削减。这提示CSE处理能诱导myostatin表达，缄默沉静myostatin基因后，CSE促进炎症介质开释的效果遭到限制，而单纯的myostatin基因缄默沉静并不影响细胞炎症介质的开释，提示myostatin并不直接参加炎症反响的上游调控，而在CSE影响后，按捺myostatin可以反响性的削减CSE所造成的的炎症反應，因而，CSE可导致myostatin水平升高，骨骼肌耗费和萎缩，炎症反响加剧，与COPD呈正相关。myostatin缄默沉静后，骨骼肌耗费和萎缩削减，可以对立CSE所造成的的炎症反响，缓解COPD[15]。卷烟烟雾成分诱导炎症介质发作后，可以经过促进蛋白分解和按捺蛋白组成来诱导骨骼肌耗费[16]，一起活化p38和ERK的MAPK信号，使用p38和ERK的按捺剂可以消除肌肉萎缩和肌球蛋白降解[17]，而吸烟者肌肉蛋白组成下降首要与myostatin表达添加有关，myostatin经过按捺Akt的活化，阻止蛋白组成的发动和细胞更新而按捺肌肉成长[18]，一起卷烟烟雾成分能减低肌肉中活化的Akt，并危害肌肉细胞的分解才能[19]。前期研讨显现，COPD患者的运动功用受限首要归因于其肺功用受损，而近年来的研讨发现，许多肺功用受损不显着的患者也存在运动功用反常[20]，而干涉myostatin来改进骨骼肌功用障碍关于更好地防治COPD炎症反响和疾病演化，改进预后，进步日子质量或许有着重要的价值。
综上所述，经过小鼠C2C12成肌细胞体外培育模型，查询卷烟烟雾提取物对myostatin表达和炎症反响的影响，并经过缄默沉静myostatin表达查询炎症反响的改动，并将myostatin作为研讨要点，为COPD骨骼肌萎缩和炎症反响的防治供给新的思路和试验根据。
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（收稿日期：2017-08-29 本文編辑：祁海文）