卵裂期胚胎培育 体外培育1 d对玻璃化冻结卵裂期胚胎移植作用的影响
程立子+吴日然+于文娟+等
[摘要] 意图 评论体外培育1 d对玻璃化冻结卵裂期胚胎移植作用的影响。 办法 挑选本中心2012年1～7月进行玻璃化冷冻并复苏的277周期卵裂期胚胎作为研讨目标，依据冻结后是否多培育1 d分为对照组和实验组。对照组在冻结当天移植，共123周期。实验组冻结后多培育1 d，共154周期。实验组又分为培育后含桑葚胚组（A组）及无桑葚胚组（B组）。调查延伸体外培育时刻对妊娠结局的影响以及培育后胚胎发育状况与妊娠结局的联系。 成果 实验组的妊娠率和着床率明显高于对照组，差异有统计学含义（P<0.05）。A组的妊娠率与着床率明显高于B组，差异有统计学含义（P<0.05）。 定论 体外培育1 d不影响玻璃化冻结后卵裂期胚胎的移植作用，延伸培育时刻有利于挑选发育杰出的胚胎并明显进步临床妊娠率和着床率。
[关键词] 体外培育；玻璃化冻结；卵裂期胚胎；桑葚胚
[中图分类号] R321 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）09（c）-0045-04
Influence of one-day culture in vitro on embryo transplantation effect of vitrification-unfreezing at cleavage stage
CHENG Li-zi WU Ri-ran YU Wen-juan XU Jian-ya LIAO Yue-chan DU Jing
Reproductive Cente，Boai Hospital of Zhongshan City Affiliated to Southern Medical University，Zhongshan 528403，China
[Abstract] Objective To explore the influence of one-day culture in vitro on embryo transplantation effect of vitrification-unfreezing at cleavage stage. Methods 277 cycles of cleavage stage embryos on revived transplantation of vitrification-unfreezing at cleavage stage from January 2012 to July in our center were selected and divided into the control group （123 cycles） and the experimental group （154 cycles） according to whether one-day more culture after unfreezing.The control group was transplantated during the same day after unfreezing，the experimental group was transplantated one-day more culture after unfreezing.The experimental group was again divided into morula group （group A） and non-morula group （group B） after cultivation.Influences on extended culture in vitro on pregnancy outcome and relationships between embryonic development after cultivation and pregnancy outcome were observed. Results The pregnancy rate and the rate of embryonic implantation in the experimental group was higher than that in the control group，with significant difference（P<0.05）.The pregnancy rate and the rate of embryonic implantation in group A was higher than that in group B，with significant difference（P<0.05）. Conclusion One-day more culture in vitro does not affect on embryo transplantation of vitrification-unfreezing at cleavage stage.Extension of culture period is beneficial to select well-developed embryo and also remarkably improves clinical pregnancy rate and rate of embryonic implantation.
[Key words] Culture in vitro；Vitrification-unfreezing；Cleavage-stage embryo；Morula
胚胎冷冻保存技能在辅佐生殖技能中占有重要位置。研讨显现，玻璃化冷冻复苏后的胚胎代谢和细胞割裂的速度比程序冷冻冻结后的胚胎更快[1]。这项技能大大进步了体外授精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的累积妊娠率，有利于防备严峻的卵巢过度影响综合征（ovarian hyper-stimulation syndrome，OHSS），在为患者削减经济负担的一起也添加了患者受孕的概率。本研讨选取玻璃化冻结后在体外培育1 d的胚胎作为研讨目标，调查其发育状况，旨在评论延伸体外培育时刻对妊娠结局的影响。
1 材料与办法
1.1 一般材料
挑选本中心2012年1～7月进行玻璃化冷冻并复苏的卵裂期胚胎作为研讨目标，共277周期，冷冻胚胎均为第3天卵裂期胚胎。依据复苏后移植时刻的不同分为对照组（当天移植组）和实验组（体外培育1 d后移植组）。对照组共123周期，均匀年龄为（31.03±4.10）岁。实验组共154周期，均匀年龄为（31.26±3.81）岁。一切患者均按本中心惯例办法进行促排卵、取卵、体外受精及培育。一切胚胎均于第3天进行玻璃化冷冻。实验组依据胚胎发育后是否含有桑椹胚分为A组（含桑葚胚）和B组（不含桑葚胚），桑葚胚指含有12～16个卵裂球的胚胎。
1.2 办法
1.2.1 冷冻胚胎挑选 依据胚胎形态学规范于第3天对胚胎进行分级，正常受精且第3天卵裂球数≥4个而且碎片≤20%的Ⅰ、Ⅱ级胚胎为可使用胚胎。经患者赞同，将移植后剩下的可使用胚胎冷冻或许将一切可使用胚胎冷冻。
1.2.2 胚胎冷冻冻结办法 玻璃化冷冻液（Vitrolife？誖，RapidVitTM Cleave，3×10 ml，REF 10117）及冻结液（Vitrolife？誖，RapidWarmTM Cleave，4×10 ml，REF 10118）由广州尊博医疗器械有限公司供给。①玻璃化冷冻办法：依照Vitrolife？誖公司RapidVitTM Cleave试剂说明书要求，将试剂从冰箱内取出后预热至37℃，将1～3个胚胎放入Vitri 1TM Cleave液中平衡5～10 min，然后放入Vitri 2TM Cleave液中2 min，可看到胚胎先舒展后康复原状，然后将胚胎转移入Vitri 3TM Cleave液中约30 s，吹打2～3次后将胚胎放到冷冻载体（克己）上，当即投入液氮中。整个进程均在37℃条件下进行。②玻璃化冻结办法：依照Vitrolife？誖公司RapidWarmTM Cleave试剂说明书要求，将试剂从冰箱内取出后预热至37℃，将装有胚胎的载体从液氮中取出，敏捷放入复苏液Warm 1TM Cleave中，10～30 s后将胚胎顺次转移至Warm 2TM Cleave 1 min、Warm 3TM Cleave 2 min，Warm 4TM Cleave 5 min，最终转入囊胚培育液Vitrolife？誖 G-2 plus中，置于37℃、6%CO2培育箱内持续培育。
1.2.3 胚胎复苏成功规范 冻结后存活卵裂球数≥50%。
1.2.4 患者的预备 ①天然周期：月经规则、排卵正常患者选用天然周期，使用阴道超声技能监测卵泡及内膜发育状况，当优势卵泡直径≥16 mm、子宫内膜厚度≥8 mm时检测是否呈现黄体生成素（LH）峰，LH峰后36 h左右排卵，排卵日开端肌注黄体酮20～60 mg/d，排卵后第3天冻结胚胎。②激素代替周期：月经不规则、排卵妨碍、子宫内膜成长不良等患者选用激素代替周期。于月经第3天重用递加法口服戊酸雌二醇（补佳乐，先灵公司），B超监测子宫内膜厚度，当内膜厚度≥8 mm时开端每日肌注黄体酮，3 d后冻结胚胎。胚胎移植在B超引导下进行。
1.3 妊娠确诊
移植2周后测定血HCG水平，阳性者为生化妊娠，35 d后走B超查看，有孕囊者则确诊为临床妊娠。
1.4 统计学处理
选用SPSS 19.0统计学软件对数据进行剖析，计量材料以x±s表明，选用t查验，计数材料选用χ2查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 实验组与对照组胚胎复苏率、均匀移植胚胎数、妊娠率与着床率的比较
实验组的妊娠率和着床率明显高于对照组，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。
2.2 A组与B组均匀移植胚胎数、妊娠率与着床率的比较
A组的妊娠率与着床率明显高于B组，差异有统计学含义（P<0.05）（表2）。
表2 A组与B组均匀移植胚胎数、妊娠率与着床率的比较
3 评论
3.1 冻融后取得高质量的胚胎是影响冷冻胚胎移植成果的重要要素
在辅佐生殖技能中，因为控制性超排卵技能的使用，90%的患者可在一次体外受精周期取得较多胚胎。本中心70%以上患者的胚胎需求进行冷冻保存。玻璃化冷冻办法安稳、高效、对胚胎的发育潜力影响最小，为防备OHSS发作起到了重要作用，乃至有人以为冻结周期移植或许会彻底替代新鲜周期移植[2]，但现在冻融进程仍不完美，胚胎经过冷冻和复苏的进程后，部分卵裂球会受损害，发作裂解凋亡或许坏死，而坏死的卵裂球也会影响其他卵裂球的发育[3]。即使是卵裂球悉数存活的冻结胚胎也有或许遭到肉眼无法分辩的损害，继而下降持续割裂的才干。研讨显现，胚胎冷冻虽然能坚持胚胎的发育潜力，但冷冻和冻结的进程会导致胚胎削减30%的发育才干，进而导致囊胚构成率和妊娠率下降[4]。
3.2 延伸体外培育时刻、调查冻结后胚胎的持续发育状况对点评胚胎发育潜力的含义
关于延伸体外培育时刻对胚胎发育的影响，现在观念尚不共同，本研讨成果与叶英辉等[4-9]的研讨成果共同，提示延伸胚胎复苏后的体外培育时刻，比较于冻结当日移植的胚胎，其妊娠率和栽培率均可明显进步，而Rato等[10]的研讨显现，胚胎冻结后培育2～5 h，其栽培率及活产率均高于冻结后培育24 h，相关研讨成果相同显现冻结后次日移植不能进步临床妊娠率和栽培率[11-13]。
延伸冻结后体外培育时刻，无疑会更有利于调查胚胎的发育状况。本研讨成果显现，冻结后大多胚胎都能康复应有的发育才干，可是其间部分胚胎发育速度较慢（如只增多1～3个卵裂球），这些胚胎在妊娠率、着床率方面明显低于正常发育的移植胚胎。罗金等[14]的研讨显现，延伸冻结后体外培育时刻，可调查到无法持续成长的胚胎，这类胚胎发育潜能低，因而，可依据冻结后胚胎成长状况来挑选发育潜能大的胚胎进行移植。此外，其研讨显现，部分已复苏的胚胎或许遭到了不可见的损害，仅少量卵裂球康复发育才干，这些胚胎的全体发育潜能较低下，这与本研讨成果共同。
3.3 胚胎发育与子宫内膜成长是否同步对着床的影响
本研讨成果显现，冻结后培育1 d后再行移植的含有发育至桑葚胚及以上的胚胎，其着床率及妊娠率明显高于移植不含桑葚胚的胚胎。冻融胚胎移植机遇的挑选非常重要，胚胎发育的速度与子宫内膜成熟度不共同也或许是导致栽培失利的原因之一。玻璃化冷冻胚胎冻结后发育速度较快，只要提早1 d预备子宫内膜，才干更好地让两者坚持共同，而冻融后挑选发育潜能好的胚胎进行移植，其着床率与妊娠率均有明显进步[15-17]。
综上所述，胚胎质量是影响冻结周期移植成功的关键要素[18]，延伸体外培育时刻不会添加胚胎本身的发育潜能，可是能够经过此种办法来调查胚胎复苏后的成长状况，继而更好地评价其未来的发育潜力。发育潜力高的胚胎与子宫内膜成熟度的同步性越高，越有利于胚胎着床。经过多培育1 d挑选出更适宜移植的胚胎，能够将发育潜力差的胚胎筛选，确保移植周期中的胚胎质量，进步临床妊娠率和着床率。
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（收稿日期：2015-03-09 本文修改：祁海文）