大鼠心肌细胞 依达拉奉联合乌司他丁对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡的影响
王媛媛+曹建+邓莉+陈勤+欧阳先国
[摘要] 意图 研讨依达拉奉联合乌司他丁对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡的影响。 办法 将50只试验动物随机分为假手术组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组、缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组，选用垫扎球囊法结扎冠状动脉制造大鼠心肌缺血/再灌注模型。测定心肌安排谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量，选用TUNEL法进行细胞凋亡检测，用Western-blot办法测定凋亡因子Caspase-3、Caspase-9的表达。 成果 与假手术组比较，缺血/再灌注组的GSH显着削减（P<0.01），MDA及心肌凋亡指数显着升高（P<0.05），Caspase-3、Caspase-9蛋白表达添加（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，各药物组的GSH活性显着添加（P<0.05），MDA含量及心肌凋亡指数显着削减（P<0.05），Caspase-3、Caspase-9蛋白表达下降（P<0.05），联合药物医治组优于独自药物医治组（P<0.01）。 定论 依达拉奉联合乌司他丁具有抗心肌缺血/再灌注损害效果，其机制或许是经过调理Caspase-3和Caspase-9介导的细胞凋亡而完成。
[关键词] 心肌缺血/再灌注损害；细胞凋亡；依达拉奉；乌司他丁
[中图分类号] R541[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）04（c）-0018-04
The influence of edaravone combined with ulinastatin on ischemia/reperfusion myocardial cell apoptosis in rats
WANG Yuan-yuan1 CAO Jian2▲ DENG Li1 CHEN Qin1 OUYANG Xian-guo1
1.Department of Cardiology,the Third Hospital of Nanchang City,Nanchang 330009,China;2.Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital to Nanchang University,Nanchang 330006,China
[Abstract] Objective To explore the influence of edaravone combined with ulinastatin on ischemia/reperfusion myocardial cell apoptosis in rats.Methods 50 cases of experimental rats were randomly divided into sham group,ischemia/reperfusion (I/R) group,I/R+edaravon group,I/R+ulinastatin group and I/R+edaravon+ulinastatin group.The experimental model of myocardial ischemia/reperfusion in rats was established by ligating coronary artery with capsule.The content of myocardial tissue glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) were determined.The cell apoptosis was detected by TUNEL and the expression of apoptosis factors Caspase-3 and Caspase-9 were determined by Western-blot.Results Compared with sham group,GSH in I/R group reduced remarkably (P<0.01),MDA and myocardial apoptotic index significantly increased (P<0.05),the expression of Caspase-3 and Caspase-9 enhanced (P<0.01);Compared with the I/R group,GSH in each drug group improved (P<0.05),MDA and myocardial apoptotic index significantly decreased (P<0.05),the expression of Caspase-3 and Caspase-9 decreased (P<0.05),the combined drug treatment group was superior to the single drug treatment group (P<0.01).Conclusion Edaravone combined with ulinastatin has the effect of anti-myocardial ischemia/reperfusion injury.The mechanism may be related to the regulation of apoptosis mediated by Caspase-3 and Caspase-9.
[Key words] Myocardial ischemia/reperfusion injury;Apoptosis;Edaravone;Ulinastatin
心肌缺血/再灌注损害（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）指短时间心肌血供中止，必定时间内康复血供，原缺血心肌发作较血供康复前更严峻的损害。研讨标明氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢妨碍、血管内皮细胞、细胞凋亡等要素均或许参加MIRI的发病进程[1-3]。本研讨在冠状动脉再灌注前给予打针依达拉奉、乌司他丁、依达拉奉联合乌司他丁进行药物后处理，与缺血后处理对照，调查其对大鼠MIRI的效果效果，并评论其机制。
1 材料与办法
1.1 试验动物及材料
取10周左右雄性SD大鼠50只，体重（200±20） g，由南昌大学动物试验中心供给。依达拉奉打针液（南京先声药业有限公司出产，国药准字20031342）10 mg/支，乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司出产，批号03080806）100 000 U/瓶，谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）检测试剂盒购自武汉亚法生物制品有限公司，Caspase-3、Caspase-9多克隆抗体购自美国Bioworld生物技术公司，碱性磷酸酶（AP）显色底物，anti-NF-κB，小鼠单抗辣根酶符号兔抗山羊IgG；anti-β-actin山羊单抗（SantaCruz 产品）。
1.2 模型制造及分组
将试验动物50只随机分为5组，假手术组（n=10），丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉打针生理盐水。其他4组参阅赵秀梅等[4]的垫扎球囊法制造大鼠体心肌缺血/再灌注模型。将充盈的球囊（215 mm×10 mm）垫于冠状动脉前降支与结扎线之间，用力结扎，调查结扎区域变白，部分心肌运动削弱，两个以上导联上呈现ST段显着上抬，提示结扎成功，45 min后将球囊快速抽暇便可立刻完成前降支血流再灌注（以心电图相关导联ST段显着回落为规范），并继续再灌注3 h。缺血/再灌注组（n=10），结扎冠状动脉后5 min别离经过尾静脉承受静脉打针生理盐水，45 min后放松扎线使冠状动脉再通构成再灌注3 h至试验完毕；缺血/再灌注+依达拉奉组（n=10），结扎冠状动脉后5 min经过尾静脉承受静脉打针依达拉奉1.5 ml/（kg·h），其他同缺血/再灌注组；缺血/再灌注+乌司他丁组（n=10），结扎左冠状动脉左室支前30 min静脉打针乌司他丁（50 000 U/kg），其他同缺血/再灌注组；缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组（n=10），结扎左冠状动脉左室支前30 min静脉打针乌司他丁（50 000 U/kg），结扎冠状动脉后5 min经过尾静脉承受静脉打针依达拉奉1.5 ml/（kg·h），其他同缺血/再灌注组。试验完毕后取大鼠左心室游离壁心肌安排敏捷置液氮中冷却并于-80℃冻存。
1.3 GSH、MDA含量测定
试验完毕后立刻别离取缺血区及正常供血区左心室心肌安排1.0 g，低温状态下生理盐水冲刷洁净，制成心肌匀浆液，离心后取上清液，按GSH、MDA试剂盒说明书操作，检测GSH、MDA的含量。
1.4 细胞凋亡的检测（TUNEL法）
心脏标本用中性甲醛溶液固定，白腊包埋，制片，切片按试剂盒进行细胞凋亡检测。凋亡指数为计数1000个心肌细胞中染色阳性的凋亡细胞。
1.5 Western-blot法检测Caspase-3、Caspase-9蛋白水平
别离取5组心肌安排，提取总蛋白，搜集上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）别离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBST常温下关闭过夜后，别离参加anti-NF-κB小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，参加辣根酶符号兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，显色。用Gel-ProAnalyzer剖析软件剖析通道蛋白的灰度值。
1.6 计算学剖析
选用SPSS 16.0计算软件对试验数据进行剖析，计量材料用x±s标明，多组间比较使用单要素方差剖析，组间两两比较使用q查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 各试验组GSH、MDA水平的比较
与假手术组比较，缺血/再灌注组的GSH含量显着下降，差异有计算学含义（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组的GSH含量显着添加（P<0.05），缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组的GSH含量优于缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组，差异有计算学含义（P<0.01）。与假手术组比较，缺血/再灌注组的MDA含量显着添加（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组的MDA含量显着削减（P<0.05），缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组的MDA含量优于缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组，差异有计算学含义（P<0.01）（表1）。
表1各试验组GSH、MDA水平的比较（x±s，n=10）
与假手术组比较，*P<0.01；与缺血/再灌注组比较，#P<0.05；与缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组比较，△P<0.01
2.2 缺血/再灌注心肌凋亡细胞TUNEL法染色成果
凋亡的细胞核呈现为黄色、棕黄色或棕褐色，首要是心肌细胞，少量为滋润的淋巴细胞和血管内皮细胞。假手术组仅见极少量散在的凋亡细胞；缺血/再灌注组凋亡细胞显着添加，凋亡细胞多位于心肌梗死区与非梗死区交界处，它首要来自于心肌细胞；缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组及缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组与缺血/再灌注组比较，凋亡细胞显着削减。与假手术组比较，缺血/再灌注组心肌凋亡指数显着添加（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组心肌凋亡指数显着下降（P<0.05），缺血再灌注+依达拉奉+乌司他丁组优于缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组（P<0.01）（表2）。
表2 各试验组心肌细胞凋亡指数的比较（x±s，n=10）
与假手术组比较，*P<0.01；与缺血/再灌注组比较，#P<0.05；与缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组比较，△P<0.01
2.3 各试验组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的比较
选用Western-blot法检测Caspase-3、Caspase-9蛋白水平，用Gel-ProAnalyzer剖析软件剖析通道蛋白的灰度值。与假手术组比较，缺血/再灌注组Caspase-3、Caspase-9蛋白添加，差异有计算学含义（P<0.01）；与缺血/再灌注组比较，缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组心肌Caspase-3、Caspase-9蛋白显着下降（P<0.05）；缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组优于缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组，差异有计算学含义（P<0.01）（表3）。
表3 各试验组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的比较（x±s，10）
与假手术组比较，*P<0.01；与缺血/再灌注组，#P<0.05；与缺血/再灌注+依达拉奉组、缺血/再灌注+乌司他丁组比较，△P<0.01
3 评论
MIRI患者心肌再灌注进程中细胞凋亡及氧自由基爆发性发作是形成再灌注损害的首要要素之一，也是内皮细胞损害的首要机制[5-6]。本试验制造大鼠缺血/再灌注模型，并给予依达拉奉、乌司他丁干涉处理，发现药物处理后，能够减轻氧化应激、下降心肌细胞凋亡指数，联合医治组优于独自药物医治组。
心肌缺血/再灌注时跟着很多氧的涌入，致使氧自由基很多发作，使膜电位不稳定，触发严峻的心律失常[7-8]。缺血心肌再灌注时发作的很多氧自由基是导致心肌缺血/再灌注的首要要素。缺血/再灌注后因为氧自由基、髓过氧化物酶及弹性蛋白酶的很多发作和许多炎症介质如激活的补体C5a、白介素、肿瘤坏死因子（TNF）等很多开释[9-10]，发作炎症反响，诱导中性粒细胞穿内皮搬迁以及对缺血心肌的滋润及损害。依达拉奉是自由基最强的铲除剂[11]，经过铲除自由基起到按捺细胞膜过氧化效果[11-12]。乌司他丁是从健康人尿中提取精制的糖蛋白，研讨标明乌司他丁关于下降炎性介质白细胞介素-6和白细胞介素-8有显着的效果[13]，能减轻炎症反响。
本试验发现依达拉奉、乌司他丁及联合干涉处理后，心肌细胞凋亡指数下降，一起凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白表达下降。Caspase-3是凋亡发作进程中所需求的一种重要的蛋白酶，也是介导细胞凋亡的中心蛋白酶。在某些应激损害要素下，可激活Caspases的启动子，首要是Caspase-9，Caspase-9承受到凋亡活化信号后经过被酶催化或自剪接而激活然后引起Caspase级联反响。Caspase-9在级联反响的上游，活化的Caspase-9进一步激活其下流的Caspase-3促进细胞发作凋亡[14]。经过GSH、MDA的检测，提示依达拉奉及乌司他丁均具有抗氧化损害的效果，而且两药合用具有协同效果。凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白表达下降，心肌细胞凋亡指数下降，两药均能够经过抗氧化损害，削减细胞凋亡的途径，对大鼠缺血/再灌注心肌起到维护效果。联合药物医治组优于独自药物医治组，合用能够一起发挥依达拉奉铲除氧自由基的才能及乌司他丁改进炎症反响的效果，更好地改进MIRI，值得进一步研讨，并使用于临床。
[参阅文献]
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[2]李凯.心肌缺血/再灌注损害与心肌细胞凋亡的研讨进展[J].医学总述，2008，14（1）：6-8.
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[14]Martin JG，Jo T.Genetic differences in airway smooth muscle function[J].Proc Am Thorac Soc，2008，5（1）：73-79.
（收稿日期：2014-03-03本文修改：郭静娟）
[基金项目] 江西省卫生厅科技方案（20142041）
▲通讯作者
[参阅文献]
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[14]Martin JG，Jo T.Genetic differences in airway smooth muscle function[J].Proc Am Thorac Soc，2008，5（1）：73-79.
（收稿日期：2014-03-03本文修改：郭静娟）
[基金项目] 江西省卫生厅科技方案（20142041）
▲通讯作者
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[14]Martin JG，Jo T.Genetic differences in airway smooth muscle function[J].Proc Am Thorac Soc，2008，5（1）：73-79.
（收稿日期：2014-03-03本文修改：郭静娟）
[基金项目] 江西省卫生厅科技方案（20142041）
▲通讯作者