阿尔茨海默病概述 网络药理学探求二至丸防治阿尔茨海默病的物质基础与效果机制
黄丽萍 燕波 侯敏 孙梦盛 何堃 官扬 姚丽华 周茂福
[摘要]该研讨选用网络药理学的办法，将阿尔茨海默病的要害靶点与二至丸化合物进行分子对接，经过Cytoscape 321 软件，树立成分靶点、靶点信号通路网络模型进行网络剖析，评论二至丸防治阿尔茨海默病的物质根底与效果机制。模仿挑选出来的30个化合物与阿尔茨海默病要害靶点及靶点会集地点的Wnt， MAPK， PI3KAktmTOR 3条信号通路均有很强的相互效果，其间有槲皮素、香叶醇、β谷甾醇、橙花醇、圣草酚5个成分可经过文献验证，开始提醒了二至丸防治阿尔茨海默病的物质根底及其在3条信号通路上的效果机制。经过网络药理学办法发现，二至丸防治阿尔茨海默病的活性成分或许是槲皮素、香叶醇、β谷甾醇、橙花醇、圣草酚，其效果机制或许与Wnt， MAPK， PI3KAktmTOR 3条信号通路有关。
[要害词]网络药理学； 分子对接； 二至丸； 阿尔茨海默病
[Abstract]The present study is to explore the material basis and mechanism of Erzhi Wan the prevented Alzheimer′s disease by using network pharmacology The key target of Alzheimer′s disease was docked with the Erzhi Wan compounds， and the drugstarget combined with targetsignal pathway network model was established by Cytoscape 321 software Thirty compounds have a strong interaction with key target of Alzheimer′s disease and three key pathways related with Wnt， MAPK and PI3KAktmTOR There are 5 ingredients such as quercetin，geraniol，betasitosterol，nerol，eriodictyol that could be verified from literatureThis result initially revealed the material basis for Erzhi Wan for Alzheimer′s disease and the mechanism in terms of three signaling pathways The network pharmacology method found that the active ingredients of Erzhi Wan for Alzheimer′s disease may be quercetin，geraniol，betasitosterol，nerol，and eriodictyol， and the mechanism may be related to three signal pathways including Wnt， MAPK， and PI3KAktmTOR.
[Key word]network pharmacology； molecular docking； Erzhi Wan； Alzheimer′s disease
阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）以进行性回忆和认知功能障碍为首要表现，其病理学特征表现为β淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）集合构成老年斑（sennepfaques，SPs）、细胞内tau蛋白过度磷酸化构成的神经细胞内神经元纤维缠结（neurofibrillarytangles，NFTs）和神经元逝世[1]。跟着老龄化程度的加剧，AD发病率逐年上升，严峻威胁老年人的生命安全，是继心脏病、癌症后的第3位死因，给家庭和社会带来严峻的经济负担[2]。现有药物能在必定程度上操控、缓解AD症状，但医治效果不抱负，因而寻觅高效药物以推迟、操控AD的发作和开展具有重要的社会含义。二至丸由女贞子（蒸）、墨旱莲（1∶1）2味中药组成，其药理效果包含保肝、进步免疫力、益智、抗衰老、抗肿瘤抗炎效果[3]，可是二至丸防治AD的物质根底鲜有人研讨，且其效果的机制尚不清楚。
作为中药研讨的学科前沿，网络药理学交融了体系生物学和多向药理学的思想，被运用到生命科学的多个范畴，如新药靶的辨认、先导化合物的发现、效果机制的研讨、物质根底的挑选等[4]，以分子对接、药物靶点网络构建以及网络特征剖析为根底的多靶点全体调控的思想办法，可进行中药多成分与多靶点的对接、剖析。因而，运用网络药理学的手法，探求二至丸防治AD的物质根底与效果机制，既有助于处理挑选物质根底时本钱高及周期长的问题，也有助于处理探寻效果机制时单靶限制性问题，便于探求二至丸的首要活性成分群和靶标群，论述二至丸物质根底和效果机制[5]。
1资料与办法
11资料
本研讨运用的软件为 DISCOVERY STUDIO中DS LibDock模块和Cytoscape 321。软件运转环境：Microsoft Windows 7 Home Basic操作体系。
12二至丸所含成分的搜集
从中药体系药理学数据库（TCMSP）[6]以及二至丸的国内外文献调研，共搜集得到二至丸167种（墨旱莲48种、女贞子119种）化学成分。经过TCMSP数据库下载分子结构后，导入软件DISCOVERY STUDIO进行三维结构转化、加氢处理及Minimize能量优化，成果保存为mol2文件格局。
13成分与要害蛋白对接endprint
经过对很多有关AD 发病机制文献的调研，挑选了与AD发病机制相关的23 个靶蛋白 [7]，在PDB蛋白质晶体结构数据库查找AchE，CaMKIIα，COX2等23个有复合晶体结构的要害靶点。运用DISCOVERY STUDIO对接软件，删去靶蛋白结构中的水分子，再加上极化的氢原子，赋予其正电荷，依据相关文献报导，提取坐落活性口袋方位的配体小分子，露出受体的活性口袋。其他参数设置为缺省值。运用DISCOVERY STUDIO对接软件，二至丸成分与23个靶蛋白进行柔性对接，其间打分函数选取的是LibDock Score打分函数。对接完成后，以LibDock Score 打分值为参阅，挑选二至丸活性分子。
14分子对接点评办法
经过查阅相关文献，选定Dock Score≥60 [8]作为二至丸活性分子与AD要害蛋白靶点是否存在较强结合活性的点评目标，为了扫除不具备类药性质的分子，运用里宾斯基（Lipinski）类药性五准则对Dock Score≥60的成分进行挑选。
15构建分子蛋白、蛋白通路效果网络图
相互效果网络图是指将彼此之间存在某种联络的分子、靶蛋白、信号通路等分子用节点（node）标明，分子与靶蛋白、靶蛋白与信号通路之间的联络用边（edge）进行标明，构成的能够显现彼此之间相互效果联络的网络图。
为了愈加明晰地阐明23个要害靶点与二至丸活性分子之间的联络及其会集地点的信号通路，运用软件Cytoscape 321，以挑选所得化合物、AD要害蛋白靶点（至少与10个二至丸成分有较好的对接成果）、化合物所属药材及AD要害蛋白靶点、靶点地点信号通路作为资料，别离构建分子蛋白效果网络图和多线性安排结构型（多下属对多上级、彼此之间协同效果）蛋白通路效果网络图，其间信号通路作为靶点归属成为节点参加蛋白通路网络构建。运用Tools面板下的network analysis核算相关网络拓扑参数。
2成果
21牢靠性验证
要验证所选取的23个靶蛋白的复合晶体结构是否牢靠，运用DISCOVERY STUDIO软件，将原配体抽离出来，然后从头对接回复合物的活性口袋，对对接后配体的构象与原晶体结构中配体构象进行核算，得到的均方根误差（RMSD）值得到小于2，证明该对接办法牢靠，见表1 [9]。成果标明所选用的蛋白结构都比较牢靠，可用于虚拟挑选。
22分子对接成果
经过挑选得到64个化合物，但这64个化合物效果的靶点数目纷歧，为了得到具有较高活性的化合物，选取效果靶蛋白数目≥5为目标，挑选出30个分子与5个或5个以上蛋白靶点有比较激烈的相互效果，23个分子与10个或10个以上蛋白靶点有激烈的相互效果，见表2，3。
23构建分子蛋白、蛋白通路效果网络图
依据对接挑选成果，运用Cytoscape 321软件，构建分子蛋白效果网络图，见图1。别的，发现除GLP1R外，其他22个要害靶点至少与10个二至丸成分有较好的对接成果。经过KEGG数据库，查找22个要害靶点所涉及到的信号通路，为了找寻二至丸效果效果显著的信号通路，设置参加信号通路的靶蛋白数≥3。汇总剖析发现，至少有3个靶蛋白地点的信号通路有3条，别离是Wnt，MAPK，PI3KAktmTOR，见图2。
23分子靶蛋白网络特征剖析
对分子靶蛋白网络的整体特征剖析标明：节点数目（number of nodes）为89，均匀相邻节点数（average number of neighbors）为9708，网络度（network density）为0110，网络中心度（network centralization）为0375，网络异质性（network heterogeneity）为0819。对靶蛋白信号通路网络的整体特征剖析标明：节点数目为13，均匀相邻节点数为1846，网络度为0154，网络中心度为0311，网络异质性为0700。成果显现，二至丸分子靶蛋白网络中既存在与β谷甾醇分子对TNFα，caspase7，CaMKIIδ，GSK3β，BchE等9个靶蛋白效果类似的1个分子对多个靶蛋白效果的现象，一起也存在与香葉醇、橙花醇、红景天苷等27个分子对AchE 1个靶蛋白效果类似的不同分子效果于同一个靶蛋白的现象，而且
PI3KAktmTOR信号通路与MAPK激酶途径、PI3KAktmTOR信号通路与非经典Wnt信号通路别离以TNFα，GSK3β靶蛋白为枢纽联络在一起而不是独立分隔的，这也正契合了中药多组分、多靶点协同效果的特色。
3评论
31活性分子剖析
结合分子对接成果和类药性剖析，终究挑选出30个至少与5个靶点蛋白的Dock Score≥60并契合Lipinski 类药性五准则的分子，其间黄酮类有cosmetin，quercetin，3′Omethylorobol，taxifolin，eriodictyol，萜类有geraniol，betasitosterol，酚类有sinapyl alcohol，salidrosid，3，4dihydroxyphenylethyl alcohol glucoside，苯丙素类有coniferin，coniferol，烯醇类有nerol。对核算得到的二至丸与AD相关的有用物质进行了文献验证，发现女贞子中的香叶醇[10]、β谷甾醇[11]、橙花醇[12]、圣草酚[13]以及2药均有的槲皮素[14]均有相关文献报导，证明晰此研讨办法的合理性。因为现阶段对单体物质防治AD的研讨不多，导致对接成果所显现的5个化合物并不包含墨旱莲和女贞子的特征性成分，这也阐明晰中药防治AD的远景宽广性。
32效果机制剖析
321MAPK激酶途径MAPK是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPK信号转导胞外和胞内的各种影响引起细胞反响。这些反响包含细胞质或细胞核靶蛋白的磷酸化然后激活转录因子，进而调理基因的表达。哺乳动物的MAPK宗族包含细胞外调理蛋白激酶（ERK）、cJun氨基结尾激酶（JNK）和p38蛋白激酶（p38 kinases）。由靶点信号通路网络图可知，与AD相关的靶蛋白TNFα，HSP70，caspase3首要会集在JNK通路，激活MAPK激酶能够调理细胞的分解、增殖、逝世和生计[15]。田允等[16]研讨标明，女贞子可经过下降caspase3的表达，削减神经元细胞的凋亡。李杰[17]的研讨标明，槲皮素经过按捺p38MAPK磷酸化，阻断JNK活化，维护神经元细胞。孔祥臣[18]研讨标明，槲皮素具有按捺热休克蛋白HSP70生成的效果，并对细胞凋亡有必定的维护效果。依据对接成果，16个二至丸成分都效果于这一通路，阐明其或许是二至丸可经过该信号通路改进阿尔茨海默病。endprint
322非经典Wnt信号通路与经典Wnt信号通路比较无β连环蛋白参加，而是其他一些离子（Ca2+）或蛋白的参加。现在研讨较多的首要包含Wnt/ Ca2+通路和Wnt/PCP（planar cell polarity）通路。由靶点信号通路网络图可知，与AD相关的
靶蛋白CaMKⅡα，CaMKⅡβ，CaMKⅡγ，CaMKⅡδ，GSK3β首要会集在Wnt/Ca2+通路，Wnt/Ca2+通路首要经过Wnt，Fz介导添加细胞内的钙离子浓度，激活蛋白激酶C和其他钙离子依靠性蛋白激酶来发挥效果 [1920]。吴婷等[21]研讨标明，槲皮素经过效果于Wnt信号通路，减轻炎症反响，促进细胞存活，减轻神经毒性，对神经炎症和痴呆症有着必定的医治效果。依据对接成果，32个二至丸成分都效果于这一通路，阐明二至丸或许经过该信号通路改进阿尔茨海默病。
323PI3KAktmTOR信号通路PI3K 宗族，是生长因子超宗族信号传导进程中的重要分子，是一类特异性的催化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）3位羟基磷酸化，发作具有第二信使效果的肌醇脂物质的激酶，它与Akt 及其下流mTOR构成细胞内一个新的信号转导通路。在此信号转导通路中，各种细胞因子能够使PI3K 活化，引起Akt 活化与细胞膜结合，在PI3K 依靠激酶（PI3Kdependentkinase，PDK） 的效果下，Akt 的丝氨酸和苏氨酸残基发作磷酸化被激活，mTOR对Akt的负调理，可按捺Akt活性，在细胞质和细胞核内，参加胞内酶联反應。与AD相关的靶蛋白TNFα，Bcl2，mTOR首要会集在PI3KAktmTOR信号通路，然后调理细胞的增殖、抗凋亡、细胞搬迁、囊泡转运等生物学进程[22]。屈岭等[23]研讨发现，槲皮素经过效果PI3KAktmTOR信号通路，诱导自噬而削减凋亡，促进细胞增殖。但关于现有文献，未发现经过效果PI3KAktmTOR信号通路，而发作抗AD效果，但依据对接成果，35个二至丸成分都效果于这一通路，阐明其或许是二至丸改进阿尔茨海默病的潜在信号通路。
综上所述，本研讨运用网络药理学办法，将分子核算、网络剖析、文本发掘等组合起来，多靶点、多方位、多层次地对二至丸的化学成分、效果靶点和相关疾病信号通路进行了探索性研讨。研讨成果开始验证了二至丸防治阿尔茨海默病的物质根底与效果机制，既表现了二至丸多成分、多靶点、协同效果的特色，也为进一步深入评论效果机制奠定了良好根底。网络药理学作为一种新式的药物研讨手法，但还存在必定的限制性，若要将得出的定论运用于临床，尚需求药理试验研讨的验证。一起，本研讨未考虑药物在制造进程中或许发作的化学反响对药物成分形成的影响，也未考虑药物配伍中剂量的挑选等，还需进一步深入研讨评论。
[参阅文献]
[1]应侠， 吴振， 雷严，等 阿尔茨海默病的发病机制及医治药物研讨进展[J]. 我国药房， 2014（33）：3152.
[2]李林 我国阿尔茨海默病研讨进展[J]. 我国药理学与毒理学杂志， 2015， 29（5）：765.
[3]蔡秀江， 黄美艳， 丁安伟，等 二至丸考源及药理效果研讨进展[J]. 我国试验方剂学杂志， 2011， 17（23）：272.
[4]刘志华， 孙晓波 网络药理学：中医药现代化的新机遇[J]. 药学学报， 2012（6）：696.
[5]Liu C X， Liu R， Fan H R， et al. Network pharmacology bridges traditional application and modern development of traditional Chinese medicine[J]. Chin Herb Med， 2015， 7（1）：3.
[6]Ru J， Li P， Wang J， et al. TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. J Cheminformatics， 2014， 6（1）：13
[7]陶晓倩， 张新庄， 李娜，等 网络药理学办法研讨赤芍和黄柏干涉阿尔茨海默病的效果机制[J]. 中草药， 2015， 46（11）：1634.
[8]李冰涛 葛根芩连汤医治2型糖尿病的配伍规则及效果机制研讨[D]. 长沙：湖南中医药大学， 2015.
[9]林卫东， 陈超， 梁生旺，等 人参皂苷改进胰岛素反抗的网络药理学[J]. 中成药， 2016， 38（7）：1455.
[10]Perry N S L， Houghton P J， Sampson J， et al. In vitro activity of S lavandulaefolia（Spanish sage）relevant to treatment of Alzheimer′s disease[J]. J Pharm Pharmacol， 2010， 53（10）：1347.
[11]Chuu C P， Kokontis J M， Hiipakka R A， et al. Modulation of liver X receptor signaling as novel therapy for prostate cancer[J]. J Biomed Sci， 2007， 14（5）：543.
[12]Howes M J， Houghton P J， Barlow D J， et al. Assessment of estrogenic activity in some common essential oil constituents[J]. J Pharm Pharmacol， 2010， 54（11）：1521.endprint
[13]Cho J K， Ryu Y B， CurtisLong M J， et al. Cholinestrase inhibitory effects of geranylated flavonoids from Paulownia tomentosa fruits[J]. Bioorg Med Chem， 2012， 20（15）：4882.
[14]Zhang X， Jin H， Li Z， et al. Quercetin stabilizes apolipoprotein E and reduces brain Aβ levels in amyloid model mice[J]. Neuropharmacology， 2016， 108：179.
[15]张雪玲， 齐晓岚， 单可人，等 阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白与MAPK信号通路的联络[J]. 我国老年学， 2011， 31（13）：2589.
[16]田允， 蔡晶， 陈旭征，等 补肾中药对帕金森病模型小鼠黑质纹状体神经元的维护效果[J]. 我国老年学， 2011， 31（3）：440.
[17]李杰 大黄素和槲皮素对LRRK2骤变致PD果蝇的医治效果评论[D]. 姑苏：姑苏大学， 2016.
[18]孔祥臣 新式化合物FLZ对热休克蛋白的诱导效果和对试验性帕金森氏病模型多巴胺体系维护效果及机制的研讨[D]. 北京：北京协和医学院， 2011.
[19]王薇， 张海廷， 王淑辉，等 阿尔茨海默病与Wnt信号通路及神经干细胞的联络[J]. 我国安排工程研讨， 2013， 17（19）：3566.
[20]De A Wnt/Ca2+ signaling pathway：a brief overview[J]. Acta Biochim Biophys Sin， 2011， 43（10）：745.
[21]吴婷， 舒建洪 槲皮素对NRTI类药物引起的神经炎症的影响及其机制的开始探求[C]. 杭州：我国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议， 2016.
[22]代文博， 曾亮 PI3K/Akt信号通路与阿尔茨海默病联络的研讨进展[J]. 现代医药卫生， 2014（10）：1499.
[23]屈嶺， 顾蓓， 张宏，等 中药筋脉通对糖尿病周围神经安排雪旺细胞自噬与凋亡的影响[C]. 北京：全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨中德代谢综合征高层论坛， 2013
[责任编辑丁广治]endprint