中药质量检测 免疫检测技能在中药质量快速点评中的使用
张波+南铁贵+孙晴+刘洪美+丁凤伟+王颖
[摘要]中药质量点评分为有用性和安全性2个方面，现有的中药质量点评办法以仪器检测办法居多，不能满意出产及日子中简略、快速、現场化的实践需求。免疫检测技能具有灵敏度高、特异性强、操作简略、检测快速、检测本钱低、仪器依靠性低、易于现场化等长处，在临床查验、食物安全检测及环境污染监测等范畴运用广泛。近些年来，免疫检测技能逐渐运用于中药质量操控范畴，触及中药有用成分的定量检测，中药有害物质检测，中药外源性污染物检测等方面。该文总述了运用较广的酶联免疫检测法和胶体金免疫检测试纸条技能的原理及在中药质量点评中的运用，该技能在中药质量现场快速检测中具有较好运用远景。
[要害词]质量点评； 快速检测； 酶联免疫检测； 胶体金免疫检测试纸条
[Abstract]The quality evaluation of traditional Chinese medicine can be divided into two aspects， effectiveness and safety. The existing methods for evaluating the quality of traditional Chinese medicine（TCM） are mostly based on the testing instruments， which can not meet the practical needs of simple， rapid and on-site in production and life. Immunoassay， characterized by simple， rapid， sensitive， specific， low-cost and high-throughput， is widely used in the fields of clinical diagnosis， environmental pollution monitoring， food safety testing， and other fields. In recent years， immunoassay technology has been gradually applied in the field of quality control of TCM， involving quantitative detection of effective components of TCM， detection of harmful substances in TCM， and detection of exogenous pollutants in TCM. This paper summarizes the principle of the wide application of ELISA and colloidal gold immunostrip technology and its application in quality evaluation of TCM， this technique has a good application prospect in the field of rapid detection of the quality of TCM. In this paper， the principles of the widely used ELISA and colloidal gold immune test strip technology as well as their application in quality evaluation of TCM were reviewed， and the results showed that this technique had a good application prospect in the field of rapid detection of the quality of TCM.
[Key words]quality evaluation； fast detection； ELISA； colloidal gold immune test strip
中药有用性和安全性是中药质量点评的2个重要标准。化学成分是中药发挥效果的物质基础，其间又以方针性成分的含量凹凸作为中药质量操控及质量好坏点评的重要方针。近些年来，跟着中药野生资源的很多削减，及依据对中药质量稳定性和可控性的需求，中药培养品逐渐成为中药商场的首要来历。在中药的培养办理进程中，农药的很多运用导致农残偏高，加上培养环境污染或加工办法不妥引起的重金属超支；存储不妥引起的细菌、真菌污染以及中药中本身存在的有毒、有害物质均影响到中药的用药安全。
跟着中药质量标准和顾客健康安全意识的进步，无论是出产者仍是顾客都期望取得一种简略、快速、高通量、现场化的检测办法来点评所用中药的质量及安全性。现在，针对中药材的质量和安全性点评运用最多的仍是依据仪器剖析的技能手段，如高效液相色谱、气相色谱、质谱、色谱-质谱联用技能等。仪器剖析具有灵敏度高、精密度高、重现性好、易于标准化等长处，但无法满意简略、快速检测的要求。免疫检测技能是依据抗原与抗体的特异性反响而树立的，对抗原或抗体完结定性定量检测的办法。免疫检测技能具有样品用量小，操作简略，检测快速，检测本钱低价，高通量及易于现场化等长处。现在在中药研讨范畴中运用最多的免疫检测办法有适用于高通量快速定量检测的酶联免疫检测吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）以及适用于现场快速检测的免疫胶体金试纸条技能（gold immunochromatography assay，GICA）。
1 免疫检测技能
1.1 抗原
中药成分品种繁复，依据化合物相对分子质量巨细一般可分为2类，一是大分子物质，如蛋白质、氨基酸、多糖类（淀粉、纤维素、植物凝集素等）；另一类是小分子物质（相对分子质量小于5 000），如黄酮类、有机酸类、生物碱类、皂苷类、萜类、蒽醌类物质等。从免疫学的视点来讲，大分子物质既具有免疫原性又具有反响原性，归于彻底抗原，而小分子物质只具有反响原性而不具有免疫原性，无法影响动物发作免疫应对，归于半抗原。中药中小分子物质占到90%以上，为了制备抗体和树立相应的免疫检测办法，需求将小分子物质与蛋白质载体相结合制备成彻底抗原。人工抗原的组成办法首要是依据小分子化合物的活性基团来挑选，如针对羧基多选用碳二亚胺法、生动酯法、琥珀酸酐法；氨基多选用戊二醛法；糖基可选用高碘酸钠法；酚羟基可选用混合酸酐法；芳香氨基选用重氮化法等。廖国平[1]、赵宁毅[2]等对中药成分半抗原的制备办法、准则、佐剂和载体的挑选以及彻底抗原的断定办法等均做了具体介绍。
1.2 抗体
依据抗体的来历及运用不同，可将抗体分为多克隆抗体（pAb）、单克隆抗体（mAb）、基因工程抗体3种。多克隆抗体一般是从致敏后的动物血液中别离血清直接运用，或进一步纯化后得到，但仍有较多杂蛋白。单克隆抗体是指由一个B细胞排泄的，性质均一、灵敏度高、特异性强的抗体，经过杂交瘤细胞技能取得。基因工程抗体是指运用重组DNA及蛋白质工程技能对编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，转染恰当受体细胞后表达的重组抗体分子。现在，在中药研讨范畴中以多克隆抗体和单克隆抗体运用较多。多克隆抗体制备周期短，获取办法简略，但抗体的性质不均一，批次间差异显着，抗原耗费量大。比较之下，单克隆抗体则灵敏度高、特异性强、性质均一且能够很多制备，是抗体制备的干流趋势。
2 ELISA在中药质量快速点评中的运用
ELISA是一种将抗原抗体的特异性结合反响与酶的高效催化反响相结合，然后完结对抗原或抗体的定性定量检测的办法。ELISA是一种固相检测办法，在中药有用成分的检测中以检测小分子化合物的直接竞赛法运用最为广泛，其基本原理见图1。
2.1 ELISA在中药质量好坏点评中的运用
中药的质量点评既包含真伪断定也包含质量好坏点评。ELISA用于药材真伪断定可经过特异性物质的有无来判别，归于化学断定范畴，但因为寻觅真伪断定特异性物质难度很大，因而ELISA在药材基原辨别中的研讨及运用较少。质量好坏点评多是检测质量操控方针性成分的含量凹凸，归于定量检测。ELISA检测技能具有操作简略、检测快速、灵敏度高、高通量等长处，弥补了HPLC检测技能的缺乏，为药典中方针性成分的快速检测供给了弥补。ELISA的技能优势使药材监管愈加方便快捷，马丽玲等[3]运用ELISA检测办法，对10份广州市售柴胡药材中的柴胡皂苷A进行含量测定，发现其间3份样品不合格，整个检测进程仅需2 h，较HPLC大大进步了检测功率。Zhang等[4]经过树立的木犀草苷ELISA检测办法，可有用区别山银花与金银花中木犀草苷的含量凹凸。现在，已有10多味中药材，20多种化学成分的抗体及ELISA检测办法的报导，其化学成分品种及相应的检测规模信息见表1。
2.2 ELISA在中药安全性点评中的运用
2.2.1 有毒成分及有害成分 跟着日子质量的进步，顾客对摄生中药的需求量不断添加，且更重视中药的安全性。影响中药安全性的要素首要有中药内源性的有毒、有害物质和外源性的农药残留、重金属污染、染色剂污染及真菌毒素污染等。有毒物质本身也是有用物质，可是假如存在不合理用药便会对人体形成损伤，如马钱子中的番木鳖碱；乌头中的乌头碱类成分等。Kido等[27]制备了乌头碱类成分的单克隆抗体，并树立了ELISA检测办法，其检测规模为100～1 500 mg·L-1，该办法运用于乌头中乌头碱的检测与HPLC检测效果相关系数在0.9以上，为川乌的质量操控及临床安全用药供给了新的检测办法。有害物质是指与药物治效果果无关的，对人体有害的一类物质，如细辛和天仙藤中的马兜铃酸A。南铁贵等[11]经过碳二亚胺法组成了马兜铃酸A的彻底抗原并制备了抗马兜铃酸A的单克隆抗体，所树立的ELISA检测办法IC50为1.9 mg·L-1，经过ELISA检测马兜铃酸A含量可有用区别木通与川木通。
2.2.2 真菌毒素类 中药在出产、贮存等进程中易发作一些真菌毒素，如黃曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素、T-2毒素、吐逆毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、桔青霉素、展青霉素等，对人体具有毒性，需加强操控。2015年版《我国药典》对19种中药中的AF含量做了清晰限制，即每1 kg中药含AFB1不得过5 μg，AFB1，AFB2，AFG1和AFG2的总量不得过10 μg，对其他毒素没有做出清晰定量规则。高效液相色谱法和液质联用技能具有专特色较强，重复性较好，假阳性率较低，能够完结多成分一起检测等长处，被选为药典AF检测的辅导办法。
ELISA凭仗其具有高灵敏度，高特异性和适合大批样品会集检测等优势在中药AF检测中运用较广。梁月秋等[31]运用ELISA检测了37种中药材和22批中成药AFB1污染状况，效果中药材和中成药的AFB1污染份额别离达到了92%，86%。李汶等[32]选用相同办法对30种中药材和7个品种20多个中成药样品进行了AFB1含量检测，发现一切样品均存在不同程度的AFB1污染，且含量均超越5 μg·kg-1。果实种子类中药因为富含油脂，在贮藏进程中易引起真菌污染，张爱婷等[33]对13种果实种子类中药的AFB1含量进行了检测，效果显现益智仁和薏苡仁中AFB1含量超支，ELISA在整个检测进程中出现出操作简略、快速、高通量、适用于杂乱基质检测等长处，检测效果杰出。陈建民等[34]比较了AF的薄层色谱检测法、ELISA检测法和免疫亲和柱净化-高效液相色谱（ICA-HPLC）检测法，以为ELISA检测技能可开展成为AF快速检测技能。但在其研讨中发现ELISA检测效果与ICA-HPLC检测办法比较AFB1的检出量显着偏高，具体原因或许是ELISA试剂盒所用的抗体存在必定穿插反响，特异性不行；再者，不同检测基质差异明显且成分较为杂乱，或许存在必定的基质搅扰。因而，制备高亲和力高特异性的抗体是ELISA检测技能的要害。部分有关AF抗体总结见表2。
2.2.3 农药残留 跟着自然资源的不断干涸及中药需求量的不断增大，人工培养品成为中药商场的干流，尤其是近十多年中药材标准化出产概念的提出和《中药材出产质量办理标准（GAP）（试行）》的出台大大进步了中药材的培养品种和培养面积，郭兰萍等[41]系统回忆了中药材标准化出产10年来的效果、存在的问题，并提出了改善定见。在中药的培养进程中，为防治病虫害及去除杂草，农药的运用频率及运用量不断进步，导致农药残留现象普遍存在，严重影响中药材质量。王丽丽等[42]剖析了我国中药农药残留的特色，指出有机氯农药残留最多，有机磷和拟除虫菊酯类农药次之，氨基甲酸酯类农药残留很少。现在，农药残留的检测办法首要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、液质联用技能（LC-MS）、气质联用技能（GC-MS）等。ELISA检测技能凭仗其超高的灵敏度（ng-pg级）和高通量检测的优势在食物农药残留检测中运用较为广泛。高宏斌等[43]总述了免疫剖析技能在拟除虫菊酯类农残检测中的运用；李卫霞[44]、武中平[45]等总结了部分国内外关于食物中杀虫剂、杀菌剂、除草剂和生物调节剂等农药残留ELISA检测技能的文献报导，均可为中药材农残的检测供给参阅。
2.2.4 重金属 重金属污染问题严重影响了药材质量，一起要挟到临床用药安全，因而我国药典已对铅、镉、砷、汞、铜等5种重金属含量做了定量规则。药材成长环境污染、药材本身富集效果以及出产加工进程中的带入污染均会引起中药重金属污染，吴亚东等[46]检测了17种常用中药材饮片中的5种重金属含量，17种药材均存在重金属超支的现象，且以镉含量超支尤为杰出。2015年版药典中重金属的检测办法选用比色法，此外还有紫外分光光度法、HPLC、电耦合等离子体质谱法、火焰萃取法、原子吸收法、分子荧光法、等离子发射光谱法、免疫检测法等[47]。现在，依据特异性抗体的重金属ELISA检测办法多用于食物（粮食、蔬菜）检测及环境监测（土壤、水），在中药材基质检测中的运用较少。5种重金属离子中，以镉离子研讨最为广泛，砷离子研讨最少，见表3。
3 胶体金免疫色谱技能在中药质量快速点评中的运用
胶体金符号抗体技能是以胶体金颗粒为示踪符号物或显色剂，运用于抗原抗体反响的一种新式固相免疫符号技能。开展至今，已广泛运用于光镜、电镜、流式细胞仪、免疫转印、体外确诊等很多范畴。1962年，Feldherr和Marshall初次介绍了胶体金作为一种电子显微镜水平的示踪符号物；1971年，Faulk等将胶体金引进免疫化学，尔后该技能在生物医学范畴运用广泛；1990年，Beggs等用免疫色谱技能检测孕妈妈尿液HCG，完结了早孕确诊的免疫学快速检测技能，即胶体金免疫色谱法。
3.1 胶体金符号抗体
胶体金是指呈胶体状态，巨细均匀的金颗粒，依据金颗粒巨细（1～100 nm）及金浓度不同显橘赤色至紫赤色。胶体金的制备一般选用化学还原法，基本原理是氯金酸（HAuCl4）在还原剂效果下聚组成必定巨细的金颗粒，其外表带有很多负电荷，发作的静电排挤力使其在水中保持稳定的胶体状态，故称胶体金。在范德华力效果下，胶体金与抗体发作非特异性结合，使抗体呈赤色但并不影响抗体的生物活性。
3.2 胶体金免疫检测试纸条
GICA是将胶体金符号抗体技能与纸色谱技能相结合的一种定性/半定量检测办法。免疫色谱试纸条是以硝酸纤维素膜为载体，滴加在膜条一端的待测液体运用微孔膜的毛细管效果渐渐向另一端渗移，在此进程中发作相应的抗原抗体反响并经过胶体金的色彩断定效果。试纸条是胶体金符号技能在免疫色谱中运用的一个重要方式，其组成分为样品垫、胶体金符号物吸收垫（载有金标抗体）、硝酸纤维素膜和吸水纸。小分子物质检测原理同ELISA，均为竞赛法，见图2，当在试纸条样品垫滴入待测提取液后，在毛细管效果下，溶液沿试纸条分散，至胶金垫时发作抗原抗体特异性结合，至硝酸纤维素膜上包被抗原线（检测线，T线）时包被抗原與待检抗原竞赛结合金标抗体，至第二抗体（对照线，C线）时，金标抗体与二抗结合。在C线出现红线的条件下，依据T线是否出现赤色进行判别。假如样本中待检测物质含量大于必定的浓度，T线不显色，效果为阳性，反之，T线显赤色，效果为阴性；假如C线不出现赤色，则阐明试纸条失效。
3.3 GICA在中药质量好坏快速点评中的运用
GICA具有灵敏度高、特异性强、样品处理简略、简洁易带着、检测快速（检测时刻5～15 min）、检测本钱低、效果肉眼可辨等长处，近10年来逐渐运用于中药活性成分的半定量检测，并在中药现场快速检测方面具有较好的开展远景。日本学者Putalun团队较早运用此技能，并先后制备了检测番泻苷A和番泻苷B（检测限为125 mg·L-1）[58]、甘草酸（检测限250 mg·L-1）[59]、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1（检测限为2 000 mg·L-1）[60]、积雪草苷（检测限12.5 mg·L-1）[61]、桑皮苷A（检测限2 mg·L-1）[62]的胶体金免疫检测试纸条，运用于中药材及中成药的检测。国内研讨较少，2006年，Zhao等[63]制备了甘草酸胶体金免疫色谱试纸条（检测规模20～50 mg·L-1），经过自来水浸泡甘草样品30 min即可完结甘草酸的半定量检测，整个进程操作简洁快速。南铁贵等[64]在人参皂苷Re单克隆抗体的基础上，制备了人参皂苷Re胶体金免疫色谱试纸条（检测限为200 mg·L-1），自来水浸提人参样品30 min后，试纸条检测10 min即可完结人参的真伪好坏断定，且断定效果与ELISA效果共同，无假阳性或假阴性效果出现。
3.4 GICA在中药安全性点评中的运用
GICA灵敏度一般在纳克及皮克等级，且运用方便，技能水平要求不高，易于推行，在临床医学（兽医临床）检测、食物安全、农兽药残留等范畴运用广泛，尤其是食物安全方面的真菌毒素检测和农药残留检测均可学习用于中药材或中成药的检测。杨英等[65]运用胶体金符号抗AFB1单克隆抗体，并拼装制备了免疫色谱试纸条用于23份莲子样品AFB1的检测，其间6份样品效果呈阳性，一切样品经UFLC-MS/MS确证后证明试纸条无假阳性和假阴性效果。王宇婷等[66]就胶体金色谱技能在包含真菌毒素、农药残留、重金属污染、抗生素残留等外源性有害物质快速检测中的运用做了具体介绍。徐超莲等[67]总结了胶体金免疫色谱法在食物天然存在的损害物质检测中的运用研讨发展。
4 总结与评论
跟着日子质量的进步，顾客对健康及食物安全重视度越来越高，中药不仅是治病救人的药物，一起还以保健品，药食同源的食材等许多身份出现给宽广顾客。因为中药野生资源的匮乏，环境污染，中药培养与出产进程中的带入污染等要素导致中药质量屡次出现问题，因而中药质量的监测不该仅限制在药材监管部门和制药企业，更应该推行到宽广的消费集体。所以，树立一种操作简略、运用门槛低、无仪器依靠且易于推行运用的中药质量现场快速检测办法是十分必要的。
ELISA检测法和GICA检测法别离作为高通量检测和现场快速定性/半定量检测技能在中药质量操控范畴的运用逐渐打开，在办法树立进程中应留意以下几点。①依据中药质量操控的要求不同树立办法：《我国药典》中的质量操控方针有些为不同类成分（如金银花中的绿原酸、木犀草苷），有些为同一类成分总和（如大黄中的蒽醌类成分）。关于绿原酸的含量测定，绿原酸的结构类似物品种多，含量也较高，因为抗体往往存在必定穿插反响，所以对检测效果会有影响，这就要求抗体的特异性越高越好；关于大黄中的蒽醌类成分，抗体穿插反响高，则可一次完结5种成分的总含量检测，无需制备各个成分的抗体，削减了本钱与检测时刻，所以抗体的特异性不需求太高。②配套提取办法的树立：中药基质杂乱，无关化学成分或许会影响方针成分检测效果的准确性，加上“快速检测”的方针需求，树立待检成分的快速提取办法也是整个快速检测系统中的要害环节。③办法稳定性：免疫检测办法易受试剂、资料、环境等要素影响，尤其是抗体易失活。怎么确保抗体的活性及办法的稳定性是需求亟待解决的问题，也是办法完结大面积推行的条件。④试纸条定量检测：现在胶体金试纸条多用于定性、半定量检测，开发便携式、微型化、自动化化的试纸条定量检测仪是未来的开展趋势。⑤中药材基原断定：依据化学成分的免疫检测技能在中药材基源断定中较难完结，核酸试纸条可供给一个有用途径。
免疫检测技能为中药质量好坏及安全性点评供给了简略、快速、高通量、现场化的检测办法，优势明显，运用远景宽广。
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