定量分析办法pdf 根据QbD理念的三七总皂苷定量分析办法继续改善研讨
戴胜云++徐冰+史新元+徐翔+孙英强+乔延江
[摘要]该文提出依据质量源于规划（QbD）的中药剖析办法继续改善战略。以三七总皂苷（PNS）5种皂苷类成分的超高效液相色谱（UPLC）定量剖析办法开发为例，完结剖析办法从HPLC到UPLC的转化。在UPLC开发中，选用PlackettBurman规划和BoxBehnken规划了解要害办法参数（CMP）与要害办法特色（CMA）之间的联系，树立贝叶斯概率规划空间；优选稳健色谱条件为初始乙腈20%，等度时刻10 min，梯度改动速率6 %·min-1，剖析时刻17 min，选用Accuracy profile进行办法学验证。在相同的剖析方针（ATP）下，从色谱条件、CMP辨识成果、CMPCMA联系模型、体系适用性等方面对PNS 的HPLC和UPLC定量剖析功能的共同性进行比较，成果标明UPLC可缩短剖析时刻、进步要害峰对别离度、色谱体系适用性满意要求，UPLC可代替HPLC进行PNS定量剖析。
[要害词]质量源于规划； UPLC； 继续改善； 贝叶斯规划空间； 三七总皂苷
[Abstract]This study is aimed to propose a continual improvement strategy based on quality by design （QbD） An ultra high performance liquid chromatography （UPLC） method was developed to accomplish the method transformation from HPLC to UPLC of Panax notogineng saponins （PNS） and achieve the continual improvement of PNS based on QbD， for example PlackettBurman screening design and BoxBehnken optimization design were employed to further understand the relationship between the critical method parameters （CMPs） and critical method attributes （CMAs） And then the Bayesian design space was built The separation degree of the critical peaks （ginsenoside Rg1 and ginsenoside Re） was over 20 and the analysis time was less than 17 min by a method chosen from the design space with 20% of the initial concentration of the acetonitrile， 10 min of the isocratic time and 6%·min-1 of the gradient slope At last， the optimum method was validated by accuracy profile Based on the same analytical target profile （ATP）， the comparison of HPLC and UPLC including chromatograph method， CMA identification， CMPCMA model and system suitability test （SST） indicated that the UPLC method could shorten the analysis time， improve the critical separation and satisfy the requirement of the SST In all， HPLC method could be replaced by UPLC for the quantity analysis of PNS
[Key words]quality by design； UPLC； continual improvement； bayesian design space； Panax notogineng saponins
三七Panax notoginseng（Burk）FHChen為五加科植物，具有散瘀止血、消肿止痛之成效[1]。三七总皂苷（Panax notogineng saponins，PNS）为三七主根或根茎经加工制成的总皂苷提取物，已收录在《我国药典》2015 年版一部[2]。药典中PNS 5种皂苷类成分的含量测定选用HPLC，乙腈水梯度洗脱，流速15 mL·min-1。该法剖析时刻长，流速大、活动相耗费大，体系背压偏高，峰型也不尽抱负。笔者曾测验选用质量源于规划（quality by design，QbD）办法进步PNS剖析办法功能。第1次办法改善时选用色谱柱（46 mm×150 mm，5 μm），将流速下降到1 mL·min-1，但剖析时刻没有改动[3]。第2次办法改善挑选色谱柱（46 mm × 75 mm，25 μm），流速为08 mL·min-1，剖析时刻缩减到36 min，要害别离度为160，根本到达色谱别离的要求[4]。
超高效液相色谱（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）具有高效、活络、快速的长处。本次研讨中以三七总皂苷UPLC开发为例，完结剖析办法从HPLC到UPLC的转化，期望缩短剖析时刻，削减有机溶剂耗费，并完成PNS剖析办法的继续改善。在PNS的UPLC开发中，首要界说剖析方针（analytical target profile，ATP），然后选用危险点评（risk evaluation）辨识要害办法特色（critical method attributes，CMAs）和键办法参数（critical method parameters，CMPs），选用回归模型树立CMAs和CMPs联系模型，依据模型开发剖析办法规划空间（design space，DSp），最终依据DSp优化剖析条件。办法开发完结后，以CMPsCMAs联系模型的准确性和体系适用性是否改动为判别规范，为点评剖析办法改善的有效性，为新剖析办法的使用供给参阅。
1资料
11仪器与试剂
Acquity UPLC HClass 超高效液相色谱仪，包含四元泵处理器、样品处理器、柱温箱、TUV 检测器及Empower 色谱工作站（Waters 公司）；AG135型电子剖析天平（1/1万，Sartorius公司）；BT25S型电子剖析天平（1/10万，Sartorius公司）；KQ100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，100 W，40 KHz）。
三七总皂苷提取物（批号ZL20141208，质量分数>80%）购自南京泽朗生物科技有限公司；三七皂苷R1（批号10745201318，纯度≥98%）；人参皂苷Rg1（批号110703201530，纯度≥98%）；人参皂苷Re（批号110754201525，纯度≥98%）；人参皂苷Rb1（批号110704201424，纯度≥942%）和人参皂苷Rd（批号111818201302，纯度≥98%）购自我国食品药品检定研讨院；甲醇为色谱级，乙腈为质谱级（赛默飞世尔科技有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水。
12数据剖析软件
DesignExpert V 80 （StatEase公司），Sigmplot 125（Aspire Software Intl，Ashburn，VA，USA），Matlab 2009a（Mathworks公司），数据处理程序自行编写，JMP（SAS公司）。
2办法与成果
21色谱条件
选用Acquity UPLC BEH色谱柱（21 mm×100 mm，17 μm）；活动相为乙腈水先等度后梯度洗脱，检测波长203 nm，进样量2 μL，流速、柱温、梯度洗脱程序由实验规划断定。
22供試品溶液的制备
称取三七总皂苷提取物约25 mg，精细称定，置10 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度线，摇匀，022 μm微孔滤膜过滤，续滤液备用。
23对照品溶液的制备
别离精细称取三七总皂苷中5种对照品适量，加70%甲醇溶解，别离从5种对照品中取必定量制造混合对照品，其间三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的质量浓度别离为0251 7，1266，0232 3，1260 1，0293 4 g·L-1。
24PlackettBurman规划
PlackettBurman规划是部剖析因规划用于挑选的备选规划。首要针对要素数较多且未断定众要素相关于呼应变量的显著性时选用的实验规划办法，能用最少实验次数挑选出要素的主效应，从很多调查要素中快速有效地挑选出最为重要的几个要素供进一步研讨。
241参数设定选取柱温（A）、梯度改动速率（B）、流速（C）、等度时刻（D）、初始乙腈浓度（E）为调查要素。依据预实验成果，为每个要素设定2个水平进行，见表1。梯度洗脱见表2。
242PlackettBurman规划成果与剖析将设定的参数水平输入JMP软件的DOE挑选实验规划中，挑选PlackettBurman规划，共12次，得到一个规划表。呼应变量选取人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的别离度和剖析时刻共2个方针进行调查。依据实验规划进行，并将成果输入呼应中，见表3。
选用最小二乘法进行效应挑选模型拟合，别离得到2个要害办法特色与5个潜在要害办法参数Pareto剖析图，见图1。图中黑色条框代表参数与呼应成负相关联系，白色条框代表参数与呼应成正相关联系，当P<005时阐明参数对呼应值影响显着，该参数为要害办法参数。对剖析时刻而言，初始乙腈浓度、梯度改动速率和等度时刻模型P<005，故可作为要害办法参数；相同，梯度改动速率为要害别离度的要害办法参数。
此外，通过最小二乘法模型运算得到要素刻画图，见图2。该图为动态演示图，首要表现2个方面，一方面是要素之间是否存在相互作用，通过移动其间任何一个要素，若其他要素斜率发作改动则标明触及要素间的交互作用，这一部分是Pareto图剖析不能表现的内容；另一方面是参数对呼应值影响的重要程度，首要通过调查猜测迹的斜率。本实验中，未发现各要素间存在交互作用，而等度时刻和梯度改动速率对2个呼应值具有必定的斜率且均较显着，初始乙腈浓度对2个呼应值具有必定的斜率但不及前2个要素显着，流速和温度对2个呼应值影响不显着。因而，归纳考虑5个要素对各呼应值的影响，等度时刻、初始乙腈浓度和梯度改动速率为要害办法参数进行进一步的调查，而影响较小的要素则挑选一个常用值，如柱温挑选室温25 ℃，流速04 mL·min-1进行后续实验。
25BoxBehnken实验规划
BoxBehnken规划与析因规划比较，可以显着削减实验次数，进步实验功率，下降实验的本钱。
251参数设定依据PlackettBurman规划调查成果，挑选梯度改动速率、等度时刻、初始乙腈浓度为要素进行实验。要素水平、BoxBehnken要素规划见表4。
252BoxBehnken规划成果与剖析将表4中的内容输入Design Expert806软件的BoxBehnken呼应面实验规划中，共17次实验，见表5。以人参皂苷Rg1和人参皂苷Re间的别离度、剖析时刻为要害办法特色进行优化。
依据成果，别离以剖析时刻和别离度为呼应值，树立呼应值与3个要害影响参数梯度改动速率、初始乙腈浓度和等度时刻之间的二项式模型，模型P<005，具有显著性，而且模型决定系数R2别离为0999 9，0878 1，标明模型拟合程度杰出，可以解说要害影响要素与要害办法特色之间的相互联系。
26规划空间开发及其可靠性研讨
BoxBehnken实验规划是呼应面规划中的一种，而规划空间又是在BoxBehnken实验规划数据上树立的，故可以为规划空间的树立是依据猜测呼应面[5]。由于树立色谱办法时往往会牵涉到多个色谱参数和多个呼应，因而规划空间应该是多个呼应面的归纳。但是Peterson[6]提出，这样由多个呼应变量树立的规划空间有2个首要缺陷，将直接导致规划空间的不可靠，其间一个缺陷是模型参数
不断定性，另一个缺陷是没有考虑多元回归模型差错向量的相关结构。因而，在树立规划空间时，有必要一起考虑这2个缺陷来保证规划空间的可靠性，这样才干满意ICH Q8指南中对规划空间界说中的“保证质量”这一项要求，Bayesian理论刚好能一起考虑模型参数的不断定性和数据结构的相关性。依据Bayesian理论，Bayesian后验猜测概率可以通过下式来核算[7]。
Pr（yA|x，data）（1）
其间，x是进程参数向量，y是呼应值向量，A是具有规则阈值的可承受规模，data是实验数据，Pr代表呼应值在可承受规模内的概率，故规划空间可以用下式标明。{x：Pr（yA|x，data）≥π}（2）其间，π标明能“確保质量”的规划空间预界说可靠性的概率。那些不断定要素对模型呼应的影响使用Monte Carlo仿真模仿来估量。
在树立贝叶斯规划空间之前，首要要断定剖析方针。本实验中，挑选2个剖析方针：①完成三七总皂苷中5种皂苷的基线别离，尤其是人参皂苷Rg1和人参皂苷Re；②缩短剖析时刻，进步剖析效能，依据贝叶斯概率可树立一个多方针规划空间。
依据剖析方针，挑选要害别离度（Rcrit）和剖析时刻（t）作为三七总皂苷色谱别离的要害办法特色，该多变量规划空间可以用下式标明。
DS={x0X|Eθ[Pr（Rcnt>λ1，t>λ2）|θ]≥π（3）
其间，x0是整个实验区域X中的一个点，λ1和λ2是要害别离度与剖析时刻的可承受阈值，π为要求到达的质量水平的贝叶斯概率值，θ为模型点评参数的数据集，Pr和E代表概率的估量值和数学期望值。
一般来说，要害别离度Rcrit至少应该大于15，而关于剖析时刻t，考虑到中药的复杂性和UPLC特色，将其设置为17 min，规划空间就是理论上的稳健区域，区域中猜测规范值高于可承受阈值而且尽或许至少到达此阈值[8]。此外，使用网格查找法在整个实验规模内进行贝叶斯联合后验概率的核算，满意2个剖析方针的贝叶斯后验猜测概率通过对每个网格进行1万次的Monte Carlo仿真模仿核算得到[810]。
现在并没有一个针对色谱剖析公认的概率阈值，故在本研讨中挑选88%作为π的根本规范树立规划空间，见图3，图中规划空间用黑线条描绘出来，规划空间内标明一起满意要害别离度和剖析时刻2个方针要求的概率至少大于88%，色彩越深，概率越大。
通过对三七总皂苷色谱剖析进程的优化，采纳Bayesian概率点评规划空间的可靠性，最终优化得到的剖析办法的猜测成果为10 min的等度时刻，6 %·min-1的梯度改动速率和20%的初始乙腈浓度，此刻可以完成三七总皂苷中5个成分的彻底别离，见图4。
27办法验证
挑选Accuracy profile[11]进行办法验证，分3 d进行，挑选4个样品浓度，每个浓度进行3次重复，总共进行3×4×3次，即36次实验。三七总皂苷样品的4个质量浓度别离是125，25，30，50 g·L-1。每个浓度别离重复3次，实验分3 d调查办法的中心精细度。依据全析因规划和β期望容许区间核算Accuracy Profile中各个参数的值，验证实验选用matlab自行编写的程序进行核算。
271真实性真实性代表总差错理论中的体系差错，别离用每个浓度3 d重复3次数据的相对差错标明。5个成分相对差错都小于5%，这阐明优化后办法的真实性可承受，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd办法验证的成果见表6～10。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 4个成分的相对差错都小于3%，而人参皂苷Re前2个浓度水平的相对差错别离为35%，32%，这或许由于人参皂苷Re含量较低，丈量时存在差错会比其他4个成分稍大。
272精细度精细度与总差错理论中的偶然差错有关，包含2个方面，别离是重复性和中心精细度，二者都用RSD标明。5个成分在4个浓度水平的重复性和中心精细度的RSD都小于2%，意味着优化后办法的偶然差错在可承受规模内，见表6～10。
273准确性准确性代表着差错理论中偶然差错与体系差错值之和，即总差错。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 5个成分在90%β容许区间内而且可承受限
为5%的准确性，见表6～10，概括图见图5。除人参皂苷Rd以外，其他4个成分在设置的4个浓度水平都散布在可承受规模内，阐明优化后的办法其准确性在设定的样品浓度规模内是可以承受的。但人参皂苷Rd则在第4个浓度水平处超过了5%可承受限，阐明其浓度规模比其他4个成分浓度规模窄。此外，优化后办法在对三七总皂苷中5个成分进行剖析时，不同成分的剖析规模不一样，但办法准确性可承受。三七皂苷R1的剖析规模为0094 61～0378 4 g·L-1，人参皂苷Rg1为0374 2～1497 g·L-1，人参皂苷Re为0039 16～0156 6 g·L-1，人参皂苷Rb1为0448 7～1795 g·L-1，人参皂苷Rd为0132 4～0493 2 g·L-1。
a 三七皂苷 R1；b人参皂苷 Rg1；c人参皂苷 Re；d人参皂苷 Rb1；e人参皂苷 Rd；绿色点为每个浓度每次实验的相对差错，赤色实线为相对差错，蓝色折线标明90%β期望容许区间，黑色点直线为±5%可承受限。
274最低定量限每个成分的最低定量限（limit of qualification，LOQ）也可从准确性概括图中看出，准确性概括约束线与90% β容许区间约束线的交叉点即为最低定量限。从实验规划的浓度来看，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 5个成分的最低定量限别离为0094 61，0374 2，0039 16，0448 7，0132 4 g·L-1。
275线性为了调查办法的线性，对36次实验数据采纳线性回归模型拟合办法得到5个成分的线性方程，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的线性方程别离为Y=4928+1510×106X，Y=-1359+1706×106X，Y=-0479 5+1849×106X，Y=0917 9+1313×106X和Y=1907×104+1570×106X，此5个成分线性方程对应的相联系数均大于0999 5，标明办法的线性杰出。
28办法继续改善前后定量剖析功能比较
在相同的剖析方针（ATP）下，从色谱条件、CMP辨识成果、CMPCMA联系模型、体系适用性等方面对笔者前期树立的三七总皂苷HPLC剖析[34]和UPLC剖析的功能进行比较，见表11。UPLC中选擇色谱柱（21 mm × 100 mm，17 μm）进行办法开发，人参皂苷Rg1和Re之间的别离度有较大改善，到达210以上，一起剖析时刻缩短到17 min，见图6。从CMPCMA联系模型视点来看，选用的实验规划办法共同，要害影响参数共同，模型R2符合要求，而规划空间的阈值更高，阐明改善今后办法的稳健性更高，更可以满意预界说方针。本次改善办法相同通过accuracy profile办法学验证，真实性、中心精细度、重复性、剖析总差错和线性均符合要求。因而，改善后的剖析办法相同满意药典中PNS的定量剖析要求，利于三七总皂苷质量操控，使用QbD东西进步了剖析办法开发的功率和可靠性。
3总结
本研讨树立了UPLC测定三七总皂苷中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 5种皂苷的Bayes概率规划空间，该方
法一改惯例单要素调查树立操作条件单一的色谱办法，而是依据科学和危险办理准则开发色谱办法的规划空间，增加了对三七总皂苷色谱剖析进程的了解，规划空间内色谱条件的改动不会引起剖析功能的改动，进步了色谱办法的稳健性。
QbD期望在药品监管和药品剖析中获得一个平衡，完成监管者、剖析者和使用者三者之间共赢[12]。本研讨在前期研讨基础上对剖析办法进行继续改善，提出选用CMPsCMAs联系模型的拟合和猜测方针，以及要害别离度、挑选性、塔板数等体系适用性方针，点评继续改善作用和改善前后剖析功能的共同性，更大程度进步办法的可靠性和可维护性，既满意监管要求，又有利于新技术的使用。
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