快速检测疟原虫试剂盒 冬虫夏草PCR快速检测试剂盒的研发与作用点评
侯飞侠+曹静+王沙沙++王茜+袁媛+彭成+万德光+国锦琳
[摘要]冬虫夏草为我国传统贵重中药材。资源缺少、价格昂贵和巨大的商场需求导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严峻，亟需树立快速有用的辨别办法。该研讨依据试验前期已树立的冬虫夏草快速判定SSPCR办法，依照体外确诊试剂点评规范开发试剂盒，并对试剂盒的特异性、检测限、重复性及保存期4项功能进行了点评。成果显现冬虫夏草质量占混合物质量的1/200（质量分数05%以上）以上时可被成功检测。试剂盒对冬虫夏草及其伪品的检测成果显现，仅有冬虫夏草可被成功扩增，并在紫外下显现绿色荧光。该试剂盒37 ℃温育7 d仍有用，阐明4 ℃保存其在1年内安稳有用。同一批次试剂盒在不同条件下，不同批次试剂盒在相同条件下，其检测成果均共同且精确，标明试剂盒具有杰出的批内及批间重复性。将该试剂盒用于市售冬虫夏草及其混伪品的检测，操作简略快速，成果精确牢靠，为下一步中药快检试剂盒的商品化奠定了根底。
[关键词]冬虫夏草； 聚合酶链式反应（PCR）； 检测验剂盒Development and evaluation of
[Abstract]Ophiocordyceps sinensis is a valuable traditional Chinese medicine. Due to resource shortage， expensive price and huge market demand， there are many adulterants of O. sinensis in markets. Therefore， it is necessary to establish a rapid and effective method for distinguishing O. sinensis. Based on the speciesspecific PCR of O. sinensis， this study developed a detection kit by optimizing the components and evaluated the specificity， detection limit， repeatability and shelf life of the kit. The results showed that when the quality of O. sinensis accounted for more than 1/200 of that mixture， it could be detected successfully. Moreover， only O. sinensis could be amplified and glowed bright green fluorescence under ultraviolet light. The kit was still in effect when it was placed at 37 ℃ for three days， which indicated that it was stable and effective for one year stored in 4 ℃. The kit in the same batch under different operation conditions， and in different batch under the same operation conditions gave the same result and accuracy， which showed good repeatability of the kit. It is simple， rapid and accurate to distinguish O. sinensis from its adulterants using the kit， and lays the foundation for commercialization of traditional Chinese medicine fast detection kit.
[Key words]Ophiocordyceps sinensis； PCR； detection kit
冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸身的枯燥复合体[1]，具有补肾益肺，止血化痰的成效，临床用于医治肾虚精亏，久咳虚喘等症，为我国传统贵重中药材。因为野生資源有限且遭到过度采挖，规模化的人工培养也没有完成，导致冬虫夏草价格昂贵。巨大的商场需求也导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严峻，亟需树立快速有用的辨别办法。现有的冬虫夏草真伪辨别办法包括性状辨别、显微辨别、理化辨别和DNA条形码技能[2]等。形状辨别首要经过调查冬虫夏草虫体和子座的色彩、巨细、足的数目、气味等[36]。显微辨别首要调查虫体中心的结构、躯壳表皮有无着生绒毛、躯壳内有无菌丝、子座横、纵切面、子囊壳的包埋方位、子囊壳及子囊孢子形状、巨细等[35， 7]。理化辨别包括：紫外吸收光谱法[8]、红外光谱法[9]、薄层色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、蛋白电泳法[12]、免疫剖析法[13]等。以上判定办法均需求判定者具有必定的理论根底和丰厚的实践经历，一起耗时长，多需求大型仪器支撑，推行难度较大。而DNA条形码技能是依据不同物种的遗传信息载体DNA的差异性来进行物种辨别，具有安稳性高，重复性好的特色，可是该技能依据测序剖析需求测序仪等大型仪器，试验投入大，周期较长，并且对NCBI等数据库依赖性强，精确度值得商讨。由此可见，现在的冬虫夏草辨别办法均不能满意快速而有用的判定要求。本研讨依据试验前期已树立的冬虫夏草快速判定SSPCR（speciesspecific PCR）办法，开发冬虫夏草快速检测验剂盒。1资料与办法
11样品
本文所用样品均经成都中医药大学国锦琳教授判定，凭据样品保存于成都中医药大学中药材规范化教育部要点试验室，样本信息见表1。
12试剂盒的组成
冬虫夏草PCR快速判定试剂盒标准为50次/盒，试剂组成见表2，其间Primer premix为1对冬虫夏草特异引物（SIF6： 5′TTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATT3′，SIR6：5′GCTTGCTTCTTGACTGAGAGGTGCC3′），依据其rDNA ITS序列的特异性位点规划而来，扩增片段巨细为174 bp。以冬虫夏草基因组DNA为阳性对照，无菌ddH2O为阴性对照。
13试剂盒的运用
试剂盒运用办法如下：①改进碱裂解法快速提取虫草基因组DNA。在约10 mg虫草子座粉末中参加80 μL Buffer A，混匀，再参加160 μL Buffer B混匀后，静置5 min，取上清液即得虫草基因组DNA。②PCR扩增：扩增体系为25 μL /PCR，包括125 μL 2×Taq PCR master mix，2 μL Primer premix，待检样品或阳、阴性对照品 1 μL，弥补ddH2O至25 μL；扩增程序为94 ℃预变性1 min，然后进行30个循环，条件为94 ℃变性30 s，67 ℃退火并延伸30 s。③荧光检测：在扩增产品中参加2 μL 100×SYBR Green Ⅰ混匀后，置紫外灯下调查是否显现绿色荧光，若显现，则为冬虫夏草，反之，则为伪品。
侯飞侠等：冬虫夏草PCR快速检测验剂盒的研发与作用点评14试剂盒的功能检测
参阅2015年版《我国药典》三部生物确诊试剂盒的要求[14]，对试剂盒的特异性、检测限、重复性和保存期等功能进行了调查。
141特异性以表1所列虫草的基因组DNA为模板，用本研讨开发的试剂盒进行特异性检测。
142检测限别离将质量为5，125，25，50，100，200，400，5 000 μg的冬虫夏草子座粉末混匀于蛹虫草子座粉末中，使混合粉末的质量为5 mg，再别离用试剂盒进行检测。
143重复性随机取同批次拼装的试剂盒3盒，别离在不同操作条件（不同操作时刻、人员、地址、人员以及不同类型的PCR仪）下对阳性对照和阴性对照进行检测，调查批内重复性，见表3。
随机选取3盒不同批次的试剂盒，在相同的试验条件下对阳性对照和阴性对照进行检测，调查批间重复性。
144保存期参阅生物确诊试剂盒保存期加快损坏试验，37 ℃保存3 d后仍有活性，标明该试剂盒可在4～8 ℃保存6个月，37 ℃保存7 d后仍有活性，标明该试剂盒可在4～8 ℃安稳保存1年。本研讨将试剂盒别离置于37 ℃ 3 d和7 d后取出对阳性对照和阴性对照进行检测，调查试剂盒的保存期。
15运用
运用该试剂盒，别离对成都荷花池中药材专业商场出售的冬虫夏草12份，伪品及金针虫虫草Cordyceps agriota各6份进行检测。
2成果
21试剂盒的特异性及检测限
运用该试剂盒对表1所列的冬虫夏草、凉山虫草、蛹虫草、古尼虫草及蝉花进行检测。仅有冬虫夏草可扩增出174 bp的意图条带。在扩增产品中参加核酸染料SYBR Green I后，仅有冬虫夏草显现绿色荧光，成果见图1。
冬虫夏草和蛹虫草不同份额混合的5 mg粉末选用本试剂盒进行检测，成果发现，含有25 μg及以上质量的冬虫夏草可显现绿色荧光，即冬虫夏草与混合物的份额为1∶200以上时可被成功检测，见图2。
22试剂盒的重复性
从2015年12月19日拼装的试剂盒中随机选取3盒，在不同操作条件（不同操作时刻、地址、人员、仪器）下别离对阳性对照和阴性对照进行测验。成果标明，阳性对照在紫外下均显现绿色荧光，阴性对照均无，阐明试剂盒具有杰出的批内重复性，见图3。在相同的操作条件下，运用3盒不同批次的试剂盒别离对阳性和阴性对照进行查验，成果显现，陽性对照均显现绿色荧光，阴性对照则不显现，阐明试剂盒批间重复性杰出，见图4。
23试剂盒的保存期
试剂盒中NaOH和TrisHCl在常温下性质安稳，而引物、含有DNA Taq酶和dNTP的2×Taq PCR master mix需在-20 ℃冻存以坚持活性。试剂盒的保质期体现了试剂盒在未经运用时自身的安稳性，本研讨参阅药典规则的生物制剂试剂盒的保存期加快损坏试验，测验成果见图5，37 ℃温育3 d，阳性对照仍可被有用扩增，37 ℃温育7 d，阳性对照仍能被有用扩增。保存期调查标明，试剂盒4 ℃保存在1年内安稳有用。
24试剂盒的实践运用
选用本研讨研发的试剂盒别离对市售的12份冬虫夏草，6份伪品虫草和6份金针虫虫草进行检测。成果见图6。 12份冬虫夏草的试剂盒检测均为阳性，而12份非冬虫夏草的试剂盒检测为阴性，阐明该试剂盒可用于检测市售冬虫夏草的真伪。
3评论
冬虫夏草产于青藏高原海拔3 000 m以上的高山草甸及灌木丛下，近年来因为全球变暖导致雪线上移，寄主昆虫蝙蝠蛾很多逝世，加之过度采挖，野生资源下降显着，现在尚无规模化的人工培养技能，但商场需求巨大，供需矛盾日益明显。全国际冬虫夏草的近缘物种有近300种，部分形状与冬虫夏草类似度极高，惯例形状辨别办法难以区别，粉末、饮片等加工品更是难以辨别，导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象频发[15]，严峻影响临床用药安全和公民健康。现判定办法大多对试验环境、操作人员经历要求高，操作杂乱，多需大型仪器，推行运用有必定的难度。而物种特异性PCR（speciesspecific PCR，SSPCR）扩增技能，经过规划高特异性的引物，序列经PCR扩增后，经过检测靶标片段的有无，然后完成辨别物种的意图。该技能特异性强，一起经过电泳图谱完成定性辨别，省去测序剖析等，降低成本，节省时刻。现在已运用SSPCR办法成功辨别了白花蛇舌草[16]、金银花[17]、蕲蛇[18]、乌梢蛇[19]、人参[20]、黄芪[21]等中药材。本研讨在冬虫夏草的SSPCR技能根底上，开发出了其快速检测验剂盒。本试剂盒首要选用改进的碱裂解法提取虫草基因组DNA，提取过程中无需离心，摆脱了其对离心机的依赖性。一起本试剂盒运用SSPCR技能对冬虫夏草进行判定，选用SYBR Green I 荧光检视替代琼脂糖凝胶电泳，无需运用电泳仪及凝胶成像体系等大型仪器，节省了时刻，使冬虫夏草的现场检测成为可能。本研讨证明了该试剂盒的特异性、重复性和安稳性杰出，对市售冬虫夏草的真伪判定成果精确牢靠，为下一步中药快检试剂盒的商品化奠定了根底。
[参阅文献]
[1]我国药典一部[S] 2015：115.
[2]Chen Y Q， Wang N， Qu L H， et al Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 58S rDNA[J] Biochem Syst Ecol， 2001（29）：597
[3]孙超不同产地冬虫夏草的质量参数测定[J]环境昆虫学报，2015（5）：1049
[4]徐如英冬虫夏草的真伪辨别[J]我国药业，2010，19（24）：69
[5]杨艳青，段军华冬虫夏草与其伪品的辨别[J]国际中西医结合杂志，2012，7（1）：31
[6]康帅，张继，林瑞超冬虫夏草的性状和显微判定研讨[J]药学学报， 2013，48（3）：428
[7]Au Dawn， Wang Lijing， Yang Dajian， et al Application of microscopy in authentication of valuable Chinese medicine ICordyceps sinensis， its counterfeits， and related products[J] Microsc Res Tech， 2012， 75（1）：54
[8]徐小东冬虫夏草的正品与混杂品的辨别办法剖析[J]医药前沿，2015，5（23）：309
[9]张声俊红外光谱法对冬虫夏草的三级判定和研讨[J]山地农业生物学报，2011，30（3）：230
[10]滕伟卓蝙蝠蛾拟青霉菌株发酵工艺优化、菌粉质量规范及免疫活性研讨[D]长春：吉林大学，2015
[11]古今，刘萍，冯建涌用高效毛细管电泳法辨别冬虫夏草及其伪品[J]药学效劳与研讨，2005， 5（3）：230
[12]陈璐贵重中药冬虫夏草特征性蛋白质成分与判定办法研讨[D]成都：成都中医药大学，2011
[13]李杨冬虫夏草免疫判定技能研讨[D]沈阳：辽宁大学，2013
[14]中國药典三部[S] 2015：378
[15]姜碧清冬虫夏草及其混杂品、掺杂品、伪品的性状辨别[J].我国药业，2009， 18（8）：56
[16]刘忠权，丁小余，丁秉中物种特异性PCR在中药材白花蛇舌草判定中的运用[J] 南京师大学报：自然科学版， 2006， 29（3）：91
[17]唐晓晶，冯成强，黄璐琦，等蕲蛇及其混杂品高特异性PCR辨别[J] 药物剖析杂志， 2006（2）：152
[18]蒋超中药现场、快速辨别办法的树立——以金银花为例[D]北京：我国中医科学院，2013
[19]唐晓晶，冯成强，黄璐琦，等高特异性PCR办法辨别乌梢蛇及其混杂品[J]我国药学杂志， 2007， 42（5）：333
[20]Wang H， Kim M K， Kwon W S， et al Molecular authentication of Panax ginseng and ginseng products using robust SNP markers in ribosomal external transcribed spacer region[J] J Pharm Biomed Anal， 2011， 55（5）：972
[21]龙平， 崔占虎， 李虔全， 等 依据位点特异性PCR的黄芪与红芪辨别办法研讨[J]我国中药杂志， 2013， 38（16）：2581[责任编辑吕冬梅]