7岁娃腺样体大面庞相片 根据ISSR技能和非腺毛特征研讨柔毛淫羊藿和近缘种遗传联系和居群遗传多样性
刘翔 付长珍 高敏 植汉成 杨相波 郭宝林
[摘要]该研讨对柔毛淫羊藿14个居群和星花淫羊藿1个居群共128个单株进行ISSR剖析，用POPGENE核算相联络数，UPGMA进行聚类剖析，以及用光学显微镜调查了每个居群叶背首要非腺毛类型和特色。研讨发现：非腺毛可分为5个形状类别，别离为长直毛、长曲折毛、伏曲折毛、拟短伏毛和长伏毛；挑选出的8个ISSR引物共扩增出94个条带，其间多态性条带90个，依据ISSR聚類剖析成果，15个居群分为3个分支，星花淫羊藿居群并没有独自为一支，应不能独立成种，应并入柔毛淫羊藿或许作为柔毛淫羊藿的种下等级；柔毛淫羊藿居群间遗传联络与地舆散布及非腺毛特征具有杰出的相关性，但也存在不一起的状况，这关于进一步研讨柔毛淫羊藿以及淫羊藿属植物的种间联络和成种办法供给了杰出的提示。居群多样性剖析标明柔毛淫羊藿居群的基因流Nm为0354 4，Nei′s基因分解系数为0585 2，阐明居群间表现出较高水平的遗传分解，首要原因或许来自柔毛淫羊藿居群自交率高和种子散布规模小。
[关键词]柔毛淫羊藿； 星花淫羊藿； 居群； 非腺毛； ISSR分子符号； 遗传多样性
Genetic relationship and population genetic diversity of
Epimedium pubescens and its related species based on ISSR and
nonglandular hair characteristic
LIU Xiang1，2， FU Changzhen1， GAO Min1， ZHI Hancheng3， YANG Xiangbo4， GUO Baolin1*
（1 Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Science， Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；
2 Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing 400065， China；
3 Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China；
4Guizhou Tongjitang Pharmaceutical Co， Ltd， Guiyang 550002， China）
[Abstract]In this study， 128 individuals form 14 Epimedium pubescens populations and 1 E stellulatum population were analyzed by ISSR marker The data were calculated by POPGENE software and clustered by UPGMA method Optical microscope was used to observe the main types of the nonglandular hairs and their characteristics in each population It is found that the following conclusions： Nonglandular hairs can be divided into five morphological categories， long straight pubescent， curly pubescent， appressed curly pubescent， pseudo short appressed hairs and long appressed Eight primers were screening and a total of 94 bands were detected in ISSR， among which 90 were polymorphic bands Based on the results of ISSR cluster analysis， 15 populations were divided into 3 clades E stellulatum populations should be incorporated into the E pubescens or as avariety under E pubescens not be independent and as it has no separate phylogenetic branch for a cluster The genetic relationship among the populations of E pubescens was closely related with its geographical distribution and nonglandular hair features But there were also some inconsistency， which provided a good hint for the further study on the interspecific relationship and natural speciation manner of Epimedium species Population diversity analysis showed Nm=0354 4， Nei′s=0585 2 It was showed that E pubescens has high genetic diversity among populations， for which the main reason was probably the high inbreeding rate and the small range of seed dispersalendprint
[Key words]Epimedium pubescens； Epimedium stellulatum； populations； nonglandular hairs； ISSR； genetic diversity
柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim是小檗科淫羊藿属植物，为《我国药典》“淫羊藿”收载来历物种[1]，也是多个来历物种中资源量最大的种类。首要散布于四川盆地及其周围山系、重庆西北部和陕西南部，甘肃的最南端也有少量散布，散布的北界为陕西的太白山，南界为四川的宜宾，西界为四川的宝兴，东界为重庆的潼南。柔毛淫羊藿生于海拔300～2 000 m的灌丛中、林下，山坡或山谷荫湿处[2]。
简略重复序列区间扩增多态性符号技能（intersimple sequence repeat，ISSR）是由Zietkiewicz等[3]创立的一种分子符号，能在分子水平上供给很多的遗传信息，具有重复性好、多态性丰厚、操作简略等长处；呈孟德尔式遗传，具显性或共显性特色，广泛使用于药用植物种类判定、遗传多样性、进化和体系发育等方面的研讨中[45]。
淫羊藿属植物丰厚的种间种内形状变异，杂乱的种间杂交联络，是植物界中分类学和体系发育最具挑战性的类群之一[6]，用RAPD，RFLP，ITS，AFLP，iPBS，以及叶绿体全基因组等分子符号剖析淫羊藿属植物的遗传联络的报导较多[610]。陈燕英等研讨发现ISSR符号可很好提醒7种川产淫羊藿属种间亲缘联络[11]。本研讨选用ISSR技能剖析了柔毛淫羊藿及叶和花形状与柔毛淫羊藿极为相似的近缘种星花淫羊藿E stellulatum 15个居群共128个个别的遗传联络，并结合本课题组以往在植物形状和非腺毛形状方面的研讨堆集，剖析这二者之间遗传联络，并评论柔毛淫羊藿种下的遗传多样性和该物种的遗传结构。
1资料
11样品供试资料为户外收集后活体保存在贵州同济堂淫羊藿种质资源圃，悉数由郭宝林研讨员判定，凭据标本存放于我国医学科学院药用植物研讨所（IMD）。本研讨共触及柔毛淫羊藿14个居群和近缘种星花淫羊藿1个居群（来自湖北十堰），共128个个别样品，收集时刻为2011年4月，收集植株上的健康稚嫩叶片，放入装有硅胶的自封袋，枯燥，备用（表1）。
12仪器Gel Doc XR凝胶成像仪（美国，BioRad），LongGeneMG96+/96 G Thermol cycle PCR仪，TG16W高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），归纳纯水仪ELGAPURE Classic型（英国，ELGA），JY300电泳仪（北京君意东方电泳仪器设备有限公司），ZEISS Axio Imager A1光学显微镜（德国卡尔蔡司公司）。
DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），Taq酶（TOYOBO），Trans 2K Plus DNA Maker、dNTPs（北京金式金生物技能有限公司），琼脂糖（进口分装），其他为国产剖析纯试剂。
2办法
21非腺毛调查每份样品取5片叶片，别离于叶脉中部，叶缘两边、叶柄及叶片顶端5部分取样，置于洁净载玻片上，水合氯醛透化，稀甘油封片。样品制片后在显微镜下调查下表皮裘茸全体特征，拍摄并丈量计算。
22DNA 提取选用CTAB法[15]提取基因组DNA，因样品含多糖，添加了去多糖处理，即称取约30 mg枯燥叶片，于液氮中研磨，将粉末转移至离心管，每管参加1 400 μL去多糖溶液，冰浴10 min、离心、弃去上清液，之后选用天根试剂盒提取基因组DNA。
23ISSR引物的挑选ISSR引物依据加拿大哥伦比亚大学（UBC）发布的序列规划，由北京奥科生物科技有限公司公司组成，共100条引物，从中挑选出8条扩增条带明晰、特异性条带多、反响安稳的引物用于悉数15个居群128份DNA 样品ISSR剖析（表2）。
24ISSRPCR扩增与检测ISSR反响体系：总体积25 μL，内含Taq酶（5 U·L-1）015 μL，10×Easy Taq DNA Polymerase Buffer（含Mg2+）25 μL，25 mmol·L-1dNTP 2 μL，引物12 μL，模板DNA 1 μL（DNA量1～2 ng），ddH2O 1815 μL。
扩增程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min（每个循环-1 ℃直到 48 ℃），72 ℃延伸1 min 50 s，需6个循环，再94 ℃ 1 min，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 50 s，34 个扩增循环； 72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
电泳条件：PCR扩增产品以15%琼脂糖凝胶检测，80 V恒压10 min，接着130 V恒压30 min，运用Bio Rad凝胶成像仪照相。
25数据的收集、计算用Bio Rad凝胶成像仪自带的Quantity One 软件，并结合人工读带。依照相同搬迁方位上有扩增带记为1，无记为0，强带和弱带均赋值为1，计算得到0，1矩阵，用于数据剖析。选用POP2GEN32软件对其进行剖析，得到各相关参数：Nei′s基因多样度指数（H）、Shannon′s表型指数（I）、集体分解系数（Gst）、多态性条带百分率（PPB）、观测等位基因数（Na）、有用等位基因数（Ne）、集体总基因多样性（Ht）、集体内基因多样性（Hs）、Nei′s遗传距离（D）和遗传一起度，并依据Nei′s遗传距离使用UPGMA法剖析各居群间的遗传分解联络。使用NTSYS pc21对柔毛淫羊藿各个别进行聚类剖析，并进一步使用AMVOA 155软件剖析柔毛淫羊藿居群内和不同居群间的变异。
3成果与剖析
31不同居群的非腺毛特征淫羊藿的非腺毛结构能够分为3个部分，基细胞（指非腺毛与表皮细胞相衔接的细胞，一般偏小，壁薄）、伸长细胞（指基细胞与顶细胞之间，相对基细胞显着伸长的细胞，壁厚与顶细胞相同，部分状况缺）和顶细胞（结尾的一个细胞，顶端尖，偶钝，壁常加厚）[12]。柔毛淫羊藿的非腺毛由基细胞和顶细胞两部分构成，顶细胞一般占毛长的80%以上（e类顶细胞占毛长的46%以上），能够分为5种类型：a类长直毛，毛长140～950 μm，直径6～25 μm，形状平直，呈剑形，顶细胞与基细胞衔接无夹角，基细胞紧缩。SCQW，SCQS，SCCZ，SCQL，SCBC，SCDJY，SCQCS，SCBZ，CQTN 9个居群皆为此种类型，是柔毛淫羊藿非腺毛的首要类型；b类长曲折毛，长390～1 250 μm，直径12～25 μm，顶细胞曲折状，与基细胞衔接无夹角，基细胞紧缩，SCLC，SCYA的样本为此种类型；c类伏曲折毛，长410～1 220 μm，直径12～25 μm，顶细胞曲折状，与基细胞T型相接，基细胞紧缩，SCHY的样本为此种类型；d类拟短伏毛，长120～380 μm直径175～25 μm，顶细胞与基细胞直接相接，但附近銜接处，顶细胞发作曲折而构成假T形相接，SCCD居群属此种类型；e类长伏毛，长350～700 μm，直径75～15 μm，基细胞为1～2个伸长细胞，顶细胞与伸长的基细胞以直角或偏斜T型相接，SXNZ居群和星花淫羊藿HBSY居群属此类型（图1）。endprint
32ISSR遗传距离和遗传一起度使用POPGENE核算了居群间Nei′s遗传距离（D）和遗传一起度（I）。D改变规模为 0111 5～0431 2，均匀 0257 8，I的改变规模为0649 7～0894 5，均匀 0774 3（表3），其间采自于SCDJY，SCQCS的这2个居群的I最高（0894 5），SCCD，CQTN的I最低（0649 7）。
33ISSR聚类剖析依据遗传一起度，使用 UPGMA法进行聚类剖析，树立15个居群柔毛淫羊藿亲缘联络树状图（图2）。15个居群的柔毛淫羊藿聚为3大类：第Ⅰ类最为杂乱，包含SCQW，SCQS，SCCZ，SCQL，SCBC，SCLC，SCDJY，SCQCS，SCHY，SCBZ 10个居群；第Ⅱ类有HBSY，SXNZ，SCCD，SCYA 4个居群；第Ⅲ类为CQTN 1个居群。
使用NTSYS pc21 对一切个别进行聚类剖析，成果标明共有11个居群为悉数个别聚在一起，各自成为一个独立分支，如SCHY，SCQW，SCCZ，SCQL，SCBC，SCCD，SCDJY，SCQCS，CQTN，HBSY，SXNZ。别的的4个居群中，SCQS的12个个别中，9个别聚为独立一支，2个个别和SCBZ的11个别聚为一个分支；SCLC的11个个别中，5个个别独自聚在一起，离CQTN的分支比较近，别的6个聚为一支，与SCYA的3个比较近；SCBZ的13个个别中，11个个别和SCQS的2个个别聚为一支，2个个别和SCYA的1个个别聚为一支；SCYA的4个个别中，除了3个个别和SCLC的6个个别聚在一起外，还有1个个别和SCBZ的4个别聚为一支（图3）。
34不同居群的遗传多样性经过8个引物对柔毛淫羊藿14个居群和1个星花淫羊藿居群共128个个别进行ISSR剖析，共检测出94个位点，其间多态性位点90个。在物种水平上，多态位点百分率（PPB）9574%，Nei′s基因多样性（H）和Shannon信息指数（I）别离是0319 7±0149 7，0483 4±0190 6。在居群水平上多态位点百分率（PPB）3617%，Nei′s基因多样性（H）和Shannon信息指数（I）别离是0129 8±0039 1，0193 5±0058 3。从各个居群来看，SCBZ，SCLC，SCQS这3个居群遗传多样性水平最高，多态位点百分率在5106%～5638%，SCDJY，SCCD，HBSY遗传多样性水平最低，多态位点在1702%～2234%，各居群的Shannon′s信息指数（I）改变趋势与多态位点一起（表4）。
35不同居群的遗传分解和基因流用POP2GEN32核算出的不同居群柔毛淫羊藿遗传变异剖析成果标明，基因流Nm为0354 4。Ht为0314 2，Hs为0130 3，各个居群之间的Nei′s基因分解系数Gst=（Ht-Hs）/Ht为0585 2，即标明：在物种水平上，有4148%的遗传变异存在于居群内，而5852%的遗传变异存在于居群间。
AMVOA对各集体的剖析成果，在总的遗传变异中有4435%存在于居群内，有5565%存在于居群间（表5），这一成果与Gst成果根本一起。阐明柔毛淫羊藿各居群之间表现出较高水平的遗传分解。
4评论
41柔毛淫羊藿和星花淫羊藿联络评论星花淫羊藿E stellulatum是Stearn依据Roy Lancaster采自湖北武当山紫云庙，培养于Royal Botanic Gardens的培养植株宣布的新种，据Stearn记载，该培养物曾由Mikinori Ogisu引自四川江油。Stearn描绘星花淫羊藿与柔毛淫羊藿的形状差异点在于：前者的叶片卵形，花梗密被腺毛，内萼片披针形，长约12 mm，宽约3 mm，花瓣有微瓣片，花药黄色；后者的叶片卵形、狭卵形和披针形，花梗被腺毛，内萼片披针形或狭披针形，长5～7 mm，宽15～35 mm，花瓣无基部瓣片[17]。依据本研讨组的很多户外调查和多居群形状调查，柔毛淫羊藿叶片形状从狭披针形到卵形，小花梗从不被腺毛到密被腺毛，内萼片的巨细、有无细微瓣片和瓣片的长短、花药由绿色到黄色都是有过渡类型的。如四川北部江油、平武、北川、松潘等地的柔毛淫羊藿内萼片较大，长8～12 mm，宽25～4 mm，具微瓣片，叶多为狭披针形至披针形，叶背非腺毛多为直毛，花药绿色。瓣片的有无在淫羊藿属植物是重要的辨别特征，但在小花类型的柔毛淫羊藿中，花瓣片从不显着到1 mm，再到2 mm与距等长等状况有逐步过渡，实难合理区分边界。因而星花淫羊藿安稳差异于柔毛淫羊藿的植物形状特色只在叶片形状，而花序和花的特征，特别是星花淫羊藿种名来自于“花大如星星”的特征实践在柔毛淫羊藿的变异规模内。本文的ISSR剖析支撑该成果，星花淫羊藿（HBSY居群）先与柔毛淫羊藿的四川雅安SCYA这一居群聚在一起，后与陕西南郑SXNZ和四川昌都SCCD居群聚在一起，此外，从非腺毛形状看，星花淫羊藿的非腺毛和柔毛淫羊藿陕西南郑居群为一个类型，阐明从花形状、遗传联络上和非腺毛特征上，星花淫羊藿都在柔毛淫羊藿的改变规模内，且与柔毛淫羊藿的陕西居群联络密切。
值得重视的是，本研讨组发现散布于湖北十堰HBSY的星花淫羊藿叶片中淫羊藿苷、朝藿定A，B，C等异戊烯基黄酮类成分的含量极低或不含，而柔毛淫羊藿的一切居群此类成分含量显着且较高[18]。依据已有数据和上述研讨，星花淫羊藿应不能独立成种，并入柔毛淫羊藿，或许定为一个种下等级，还待于进一步的研讨。
42遗传差异和形状地舆的联络剖析柔毛淫羊藿首要散布于四川盆地及其周围山系，向北跨过大巴山系抵达秦岭山系（即陕西南部和湖北西北部）。一般来说由于地舆阻隔一方面阻断了基因沟通，另一方面环境差异促进了遗传的分解，所以地舆距离与遗传距离呈现较好的相关性。研讨得到的一切居群UPGMA聚类图（图1）在地舆距离和遗传联络上有必定联络，如SCQL，SCDJY，SCQCS 3个居群地舆距离较近聚在一起。其间个别聚类剖析（图3）比居群聚类剖析表现出更高的地舆散布联络，如SCQW，SCHY聚在一起，CQTN，SCLC 5个个别聚在一起。形成个别聚类与居群聚类不一起的原因之一是SCQS，SCBZ，SCLC，SCYA 4个居群发作了分解，也就是一个居群不同个别与不同的居群发作了聚类，相同个别聚类剖析与非腺毛形状的联络也更为一起，如：相同为e类长伏毛的HBSY，SXNZ聚在一起，同为b类长曲折毛的SCLC 6个个别和SCYA 3个个别聚在一起。可是地舆分解和非腺毛形状表型与遗传聚类剖析仍是有许多不一起。梁琼等经过AFLP分子符号对箭叶淫羊藿E sagittatum 12个不同居群形状及遗传多样性比较研讨，成果发现聚类联络与地舆散布密切相关，形状聚类与遗传聚类剖析仍是有许多不一起，并且形状聚类与地舆散布的相关性也低于遗传聚类，标明箭叶淫羊藿形状的多样性与遗传联络之间联络的杂乱性[13]；植物类群的多型现象是地舆分解和生态分解的成果，但就发生变异和分解的内涵机制而言，表型可塑性改变、生态宗的分解、地舆宗的分解以及地舆梯度的变异、染色体变异，特别是染色体多倍化、种间杂交和无交融生殖等，都是重要的要素，并且一般多少会对植物的外部形状发生影响[14]。阐明柔毛淫羊藿遗传多样性的復杂性，除了常见的地舆距离和形状多样性以外，或许与柔毛淫羊藿与同属其他物种杂交的成果，如SCCD居群呈现拟短伏毛与箭叶淫羊藿和粗毛淫羊藿常见的短伏毛比较相似，是SCCD居群独立进化而来仍是与箭叶淫羊藿或粗毛淫羊藿发作了杂交而来，值得进一步研讨。endprint
43不同居群非腺毛与遗传联络的联络非腺毛是由植物表皮细胞特化而成的突起物，其显微结构特征可由于植物种类不同而有相当大的改变，不少研讨标明，非腺毛形状可作为物种分类的重要依据[15]。前人对淫羊藿属植物植物非腺毛进行了研讨，以为淫羊藿属植物叶背非腺毛结构特征专特色强，在种间存在差异，具有分类学价值[16]。但大都研讨针对某一种类只进行了1个或少量几个居群的研讨，没有进行多个居群的研讨，笔者经过对多个居群淫羊藿属植物非腺毛研讨发现，散布规模广的物种如箭叶淫羊藿E. sagittatum、天平山淫羊藿E. myrianthum、柔毛淫羊藿等具有多个类型的非腺毛，本文将柔毛淫羊藿的非腺毛细分为5个类型。
柔毛淫羊藿最常见的是a类长直毛，并且在具有b～e类型毛居群的非腺毛中或多或少能看见a类长直毛，所以柔毛淫羊藿中a类长直毛是最典型也是最原始的非腺毛，b等类型为次生类型。短伏毛成都居群和e类长伏毛陕西南郑和湖北十堰归于聚类剖析的第Ⅱ类。笔者经过ISSR分子符号与不同居群的非腺毛进行了比较，伏毛和直毛在遗传多样性上分为2类。
在仅具有a类长直毛9个居群其间8个居群归于ISSR依据遗传一起度聚类剖析的第Ⅰ类，CQTN居群归于遗传一起度聚类剖析的第Ⅲ类，b类长曲折毛SCLC居群和c类伏曲折毛SCHY居群也归于第Ⅰ类，b类长曲折毛SCYA居群归于第Ⅱ类，b类长曲折毛应该是在a类长直毛根底上的变异类型，即顶细胞发作了曲折，c类伏曲折毛又在b类长曲折毛根底发作了顶细胞与基细胞发生夹角。洪雅c类伏曲折毛，尽管也属伏毛大类，或许由于与其他直毛居群地舆距离较近，遗传多样性依然归为Ⅰ类，别的3个居群2种伏毛，d类拟短伏毛和e类长伏毛归为Ⅱ类。
44遗传多样性和遗传结构遗传多样性一般是指种内的遗传差异水平，反映一个物种适应环境的才能及其被改造和使用的潜力。本研讨使用挑选到的 8条ISSR 引物在15个不同居群柔毛淫羊藿中检测到了较丰厚的遗传多样性，多态位点百分率（PPB）到达9574%，Shannon（I）多样性指数0483 4±0190 6。如此丰厚的遗传多样性，阐明柔毛淫羊藿具有较强的区域适应才能和进化潜力。
遗传结构就是遗传变异或许说基因和基因型在时刻和空间上的散布款式，是一个物种最根本的特征之一，它受骤变、基因流、挑选和遗传漂变的一起效果，一起还和物种的进化前史和生物学特性有关[19]。Hamrick等[20]研讨成果标明，植物类群的分类位置、习性、交配体系、种子分散机制、散布区域和演替阶段对居群遗传分解程度都有明显的影响。而其间交配体系（远交或近交所占份额）、散布规模和生活型对居群遗传结构的影响最大[21]。近交，不管是自交仍是血缘附近个别间的交配，均会添加结合配子之间的一起性，下降重组然后导致家系内的个别愈加一起，家系间呈现遗传分解。本研讨显现柔毛淫羊藿基因流Nm 0354 4，阐明居群间基因沟通很少。基因分解系数Gst 0585 2，各居群间存在较大的遗传分解，是Hamrick等[20]得出的均匀值0228 0的2倍多，其原因或许有以下几点：柔毛淫羊藿自交率高。Suzuki[22]对日本淫羊藿属植物的研讨标明：淫羊藿为可兼性自花授粉的虫媒花，共有2种类型的传粉者，一类是一些专门收集花粉的小蜂；另一类首要是汲取花蜜为食的中等巨细或体型更大些的蜂类，前者光临一切的花朵，而后者是挑选性的光临。收集花粉型的蜜峰对淫羊藿属种内的基因流起了重要的效果，而汲取花蜜型的蜂类经过它们有挑选的授粉则加强了淫羊藿属各种间的分解。这些传粉者常常访问同一花序或同一植株不同花序的多个花朵然后才转移到另一植株上，一般是同株授粉，即自交率高，自交會导致居群间的遗传分解；柔毛淫羊藿种子散布规模小。淫羊藿以种子繁衍为主，结实率中等，种子散布首要靠天然散落、蚂蚁转移，偶尔状况下的水流转移，淫羊藿属植物的种子具有白色附属物，被以为这更或许是蚁播植物的特色[23]。在植物中，基因流是经过花粉和种子分散完成的，柔毛淫羊藿从花粉和种子散布上都规模小，因而导致居群之间的遗传分解明显；本文的研讨目标根本覆盖了柔毛淫羊藿散布的首要区域，除了SCQCS，SCCZ和SCHY，SCYA居群间直线地舆距离较近外，其他个居群间都相距较远，皆超越50 km，地舆距离较远。综上所述各种要素阻止了基因沟通，终究导致了居群间较高的遗传分解。
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[责任编辑吕冬梅]endprint