丹参酮iia磺酸钠 丹参酮ⅡA磺酸钠对AngⅡ诱导心房成纤维细胞胶原组成及TGF—β1活化的影响

杨乐+邹晓静+尹钊+郝洪真

[摘要] 意图：调查丹参酮ⅡA磺酸钠（sodium tanshinone ⅡA sulfonate， STS）对血管严峻素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）诱导心房成纤维细胞胶原组成及TGF-β1活化的影响。办法：培育重生大鼠心房成纤维细胞，检测胶原含量，并[³H]-脯氨酸掺入法测定胶原组成速率作为心肌纤维化方针。ELISA法检测培育细胞上清中活性TGF-β1及总TGF-β1含量。Western blot测定血小板反响素-1（thrombospondin-1，TSP-1）表达。成果：AngⅡ可以显着上调心房成纤维细胞胶原含量、胶原组成速率；TSP-1表达及活性TGF-β1排泄量上调，而总TGF-β1表达无显着改动。在STS处理后，除总TGF-β1外，其他方针均显着下调。定论：STS能减轻AngⅡ诱导心房成纤维细胞胶原排泄及组成速率，机制与按捺TSP-1/TGF-β1通路有关。

[关键词]丹参酮ⅡA磺酸钠；心房纤维化；转化成长因子-β1

心房颤动（房颤）为临床最常见的快速性心律失常，严峻危害人类健康，可致心功用不全及脑栓塞等并发症，显着添加患者死亡率^[1]。新近研讨提示在多种要素所构成的房颤模型，均可见显着的心房纤维化（atrial fibrosis），后者搅扰部分激动传导，构成单向传导阻滞，添加激动不均一性和碎裂电活动，促进房颤保持。因而，心房纤维化是房颤保持的关键要素，严峻危害心功用^[2]。寻觅医治心房纤维化的医治办法是改进房颤患者愈后的新途径。

研讨标明血管严峻素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）是心房纤维化发病机制中重要的一环，可经过血小板反响素-1（thrombospondin 1，TSP-1）/转化成长因子-β1（TGF-β1）途径诱导心肌重构^[3-4]。我国传统中药丹参临床上首要用于冠心病的医治^[5]，本室也发现其能按捺心肌重构^[6]，但其对心房纤维化研讨尚少。本试验使用培育的重生大鼠心房成纤维细胞，研讨丹参的首要成分丹参酮ⅡA衍生物“丹参酮ⅡA磺酸钠”（sodium tanshinone ⅡA sulfonate， STS）对AngⅡ诱导的胶原排泄及组成速率，TSP-1/TGF-β1通路的影响， 评论STS抗MF的或许机制， 为其在临床用于防治心房纤维化供给试验根据。

1 资料

1.1 动物 1～2 d龄重生Wistar大鼠，由同济医学院试验动物中心供给，动物许可证号SCXK（鄂）2004-0007。

1.2 试剂与仪器 AngⅡ（Sigma公司）；STS（我国食品药品检定研讨院，批号S02001300）；DMEM干粉培育基、胰蛋白酶、胎牛血清、[³H]-脯氨酸（我国科学院上海原子能研讨所）；PMSF和leupeptin（Sigma公司）；PVDF膜（Amersham公司）；羟脯氨酸试剂盒及TGF-β1 ELISA试剂盒（南京建成生物工程有限公司）；小鼠抗大鼠TSP-1（Santa Cruz公司）；其他试剂为国产剖析纯。LS3810 液体闪耀仪（Beckman公司），笔直电泳仪及转膜体系（Biorad公司）。

2 办法

2.1 重生大鼠心房成纤维细胞（atrial fibroblasts， AFs）培育 取1～2 d龄的Wistar大鼠，在无菌条件下开胸剪取心室肌，无菌条件下剪碎心肌，0.1%胶原酶消化液消化后，参加含10胎牛血清的IMDM培育液制成细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵个/mL，根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时刻的不同，选用差速贴壁1 h，去除心肌细胞取得成纤维细胞。持续培育细胞至近交融状况时按1∶2传代。传代后成纤维细胞用抗波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体免疫细胞化学染色判定，纯度到达95%。试验用第3～5代的细胞。

2.2 分组 共分为5组，别离为①对照组，给予生理盐水；②AngⅡ（0.1 μmol·L^-1）组；③AngⅡ（0.1 μmol·L^-1）+STS（3 μmol·L^-1）组；④AngⅡ（0.1 μmol·L^-1）+STS（10 μmol·L^-1）组；⑤AngⅡ（0.1 μmol·L^-1）+STS（30 μmol·L^-1）组。

2.3 羟脯氨酸法测定胶原蛋白含量 各干涉要素处理细胞48 h后，取细胞上清液0.5 mL，加无水乙醇1.2 mL，旋涡混匀器充沛混匀2 min，2次，3 500 r·min^-1离心10 min，取上清（约1.5 mL），烘干，加0.5 mL双蒸水复溶，制成稀释倍数为1的检测液，加试剂1，2，3（详细见试剂盒说明书），混匀，65 ℃水浴15 min，冷却后，在550 nm波长比色。胶原蛋白含量=7.46×羟脯氨酸含量（羟脯氨酸含量占胶原的13.4%）。羟脯氨酸=（A测定管-A空白管）/（A规范管-A空白管）×规范管浓度×稀释倍数。

2.4 胶原组成（[³H]-proline掺入率）的测定 AFs接种到24孔培育板，贴壁成长至集合状况后，替换无血清培育液，持续培育48 h，使AFs处于G0/Gl期。替换新的培育液（含0.4%FCS-DMEM及0.3 mmol·L^-1抗坏血酸），参加上述各组干涉，一起每孔参加37×10⁶Bq·L^-1的[³H]-proline，共育30 h后，0.25%的胰酶消化并搜集细胞。在0.22 μm的醋酸纤维素微孔滤膜上负压抽滤，生理盐水和10%的三氯乙酸冲刷滤膜，95%乙醇脱色，烘干后置入闪耀瓶中，参加二甲苯闪耀液4 mL，静置过夜后，在液体闪耀仪计数器（Tri-carb2300，美国Packard公司）上进行放射性强度的测定。endprint

2.5 ELISA法测定活性TGF-β1及总TGF-β1含量 按TGF-β1免疫检测试剂盒说明书别离检测细胞培育上清中活性TGF-β1及总TGF-β1含量。总TGF-β1检测样本需经1 mol·L^-1盐酸化处理；活性TGF-β1检测选用非盐酸化处理的上清液。各组所得成果与对照组进行比照，进行计算剖析。

2.6 总蛋白的提取 取5×10⁵个各组干涉后的心房成纤维细胞，参加5倍体积的裂解液孵育20 min，其组成为：Tris-HCl 50 mmol·L^-1pH 8.0，NaCl 150 mmol·L^-1，EDTA 0.5 mmol·L^-1，DTT 1 mmol·L^-1， NP-40 1%，脱氧胆酸钠0.5%，SDS 0.1%，钒酸钠100 μmol·L^-1，PMSF 100 mg·L^-1，apmtinin 1 mg·L^-1，leupeptin 2 mg·L^-1，冰浴条件下进行安排匀浆，4 ℃，12 000 r·min^-1离心10 min，取上清，用Folin酚法进行蛋白定量后保存于-70 ℃。

2.7 免疫印迹法检测TSP-1蛋白表达 取40 μg总蛋白参加上样缓冲液煮沸3 min变性，经SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后电转移至PVDF膜上，关闭后与l∶1 000稀释的TSP-1一抗4 ℃孵育过夜，与1∶1万稀释的二抗室温孵育l h，再与化学发光试剂ECL温浴l min后曝光、显影和定影，对成果进行吸光度扫描。用方针蛋白表达量的灰度值除以内参表达量的灰度值，以所得的比值标明方针蛋白的相对表达量。

2.8 计算学处理 一切数据均选用〖AKx-D〗±s标明，用SPSS 12.0计算软件包进行单要素方差剖析，以P<0.05为差异具有计算学含义。

3 成果

3.1 STS对AFs胶原含量的影响 0.1 μmol·L^-1AngⅡ能显着进步羟脯氨酸含量（P<0.01）。3， 10， 30 μmol·L^-1STS处理后，羟脯氨酸含量显着削减（P<0.01），见表1。

3.2 STS对AFs胶原组成速率（[³H]-proline掺入率）的影响 0.1 μmol·L^-1AngⅡ效果24 h 后，AFs胶原组成速率较对照组添加至（175.88±19.22）% （P<0.01），而3，10，30 μmol·L^-1STS处理后能显着按捺AngⅡ诱导的AFs胶原组成速率的添加（P<0.01），见图1。

〖XC杨乐-1.TIF〗

与对照组比较¹）P<0.01；与AngⅡ组比较²）P<0.05，³）P<0.01（图2，3同）。

图1 STS对AFs胶原组成速率的影响（±s，n=5）

3.3 STS对活性TGF-β1及总TGF-β1含量的影响 新近研讨标明，循环或部分AngⅡ首要经过活化TGF-β1而促心房纤维化。因而，为进一步评论STS按捺AngⅡ诱导心房成纤维细胞胶原含量及胶原组成速率添加的机制，用ELISA法检测各组活性TGF-β1（A-TGF-β1）及总TGF-β1（T-TGF-β1）含量，数据显现Ang Ⅱ显着上调A-TGF-β1表达（P<0.01），而对T-TGF-β1表达无显着影响，成果与以往报导一起^[3]。STS干涉后，A-TGF-β1表达显着下调（P<0.01），见图2。

3.4 STS对TSP-1蛋白表达的影响 研讨标明，AngⅡ诱导TGF-β1活化的关键要素是血小板反响素-1（TSP-1）^[3]。为证明STS按捺AngⅡ诱导TGF-β1活化的机制，用免疫印迹法检测各组TSP-1蛋白表达， 数据显现TSP-1表达被STS显着按捺（P<0.01），见图3。

4 评论

心房颤动（房颤）的发作源于心脏电生理改动和心房结构重塑的一起效果。心房纤维化会引起细胞外基质堆积与降解失衡，以及成纤维细胞的过度增殖等。前期研讨显现心室纤维化会引起心室壁进行性硬化，进而引起心室功用不全和充血性心力衰竭。但随后的研讨杰出显现了心房纤维化与房颤的联系，与瓣膜病、高血压和老龄化的联系。调控心房纤维化也成为临床上医治房颤患者的重要途径^[7]。但是现在用中草药干涉这一进程的研讨尚少^[7]。

我国传统中药丹参具有抗缺血缺氧、改进微循环、按捺血小板黏附集合功用和抗血栓构成效果， 临床上首要用于冠心病的医治^[5]。但其对心肌纤维化的效果报导较少。 本试验用培育的重生大鼠心房成纤维细胞研讨丹参的首要成分丹参酮ⅡA衍生物STS对AngⅡ诱导心房成纤维细胞胶原组成的影响，发现STS能显着下降AngⅡ诱导的胶原含量及组成组成速率上升，但机制没有彻底明晰。

研讨证明，在心房成纤维细胞，AngⅡ首要经过上调一些促纤维化的成长因子，直接促进纤维化，其间最重要是TGF-β1^[8]。TGF-β1分为活性和非活性2种方式存在，而真实行使促纤维化效应的是活性TGF-β1。本研讨标明，AngⅡ能上调活性TGF-β1水平而对总TGF-β1水平没有显着影响，这也与既往研讨成果类似^[3]，而STS处理后可以显着下调活性TGF-β1水平，说明STS正是经过按捺AngⅡ诱导的TGF-β1活化而下降胶原组成的。endprint

血小板反响素-1（TSP-1）也称凝血酶灵敏素-1，是一个相对分子质量为450 kD 的同源三聚体基质糖蛋白，开始发现于血小板α颗粒内，随后被证明可由成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和单核细胞等多种细胞排泄^[9-10]。研讨标明，在AngⅡ活化成纤维细胞TGF-β1的机制中，TSP-1起到了非常重要的效果^[3]。本研讨显现，AngⅡ显着上调心房成纤维细胞TSP-1表达，而STS处理后，TSP-1表达被显着按捺。

综上所述，STS能减轻AngⅡ诱导心房成纤维细胞胶原排泄及组成速率，机制与按捺TSP-1/TGF-β1通路有关。下一步研讨要着重于STS对AngⅡ-TGF-β1其他下流分子的影响，如Smads，TGF-β激活的蛋白激酶-1（TKA-1）等^[5]，进一步说明STS抗心肌纤维化的机制，为其在临床用于心房纤维化的防治供给试验根据。

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Effect of sodium tanshinone ⅡA sulfonate on AngⅡ-induced atrial

fibroblast collagen synthesis and TGF-β1 activation

YANG Le ZOU Xiao-jing²*， YIN Zhao HAO Hong-zhen³

（1.Department of Emergency Internal Medicine， Tongji Hospital of Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China；endprint

2. Department of Anesthesiology， Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430022， China；

3. Department of Pharmacology， Tongji Medical College of Huazhong University of

Science and Technology， Wuhan 430030， China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of sodium tanshinone ⅡA sulfonate （STS） on Ang Ⅱ-induced atrial fibroblast collagen synthesis and TGF-β1 activation. Method： Atrial fibroblasts of neonatal rats were cultured to determine the content of collagen protein. The original synthesis rate determined by the [³H]-proline incorporation method was taken as the index for myocardial fibrosis. The content of active TGF-β1 and total TGF-β1 in cell culture supernatants were tested and cultured by ELISA. The expression of thrombospondin-1 （TSP-1） was assessed by using Western blot. Result： Ang Ⅱ could significantly increase the content of atrial fibroblast collagen and the collagen synthesis rate， the TSP-1 expression and the concentration of active TGF-β1， without any obvious change in total TGF-β1. After the STS treatment， all of the indexes， apart from total TGF-β1， were obviously down-regulated. Conclusion： STS could decrease the secretion of Ang Ⅱ-induced atrial fibroblast collagen and the synthesis rate. Its mechanism is related to the inhibition of TSP-1/TGF-β1 pathway.

[Key words] sodium tanshinoneⅡA sulfonate； atrial fibrosis； transforming growth factor-β1

doi：10.4268/cjcmm20140627endprint