黄芪当归参川芎配比 当归—川芎药对不同制法与配比抗氧化活性相互作用研讨
黄美艳，唐于平，尚尔鑫，郭建明，刘欣，王林艳，李伟霞，段金廒
[摘要] 意图：运用呼应曲面剖析法调查归芎药对不同制法、不同配比对DPPH自由基铲除率体外抗氧化活性的相互效果研讨。办法：选用2，2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）自由基铲除率法测定当归-川芎10个配比，3种不同提取办法的提取物的抗氧化活性，运用非线性回归的办法确定量效曲线的各个参数，树立三维呼应面模型，运用Matlab软件构建呼应曲面的三维图形。成果：不同配比不同制法的30个样品，均具有显着的铲除自由基活性，且表现出显着的量效联系。水提液的协同效果规模窄，简直成点状散布，拮抗效果规模呈6条宽窄纷歧的条带状散布；醇提液的协同效果呈小条状散布，拮抗效果呈点状散布。在先水提后醇提液协同效果呈条状散布（3条），拮抗效果呈点状散布。总归先水提后醇提液的协同效果区域大于醇提液，水提液次之；3种提取办法大部分区域均未表现出显着协同与拮抗效果。定论：选用呼应曲面剖析法定量研讨中药配伍药物相互效果，为相关研讨供给了思路与办法的参阅。
[关键词] 当归；川芎；药对；抗氧化；DPPH；呼应曲面剖析法；相互效果
中医多以数味中药配伍构成的丹方为载体医治疾病[1]。配伍是中药用方的魂灵。药有特性之专长，方有合群之妙用，药物的联合运用才干发作药物的相互效果，首要表现在效应的强度、毒性以及效果时刻上的一些改变。两药配伍后可发作相加性、协同性或拮抗性药物相互效果[2]。研讨办法有定性的辐射剖析法、分数剖析法、概率剖析法和定量的呼应曲面剖析法等[3]。
当归-川芎为临床常用药对，历史上许多闻名的丹方均是由这2味药物组成，历代许多妇科良方如四物汤及其类方均含有这2味药，但因为不同的配伍份额，使得这些丹方发作了不同的成效及临床主治[4]。现代药理学研讨标明归芎药对具有抗氧化效果[5-6]，氧自由基触及归芎所运用的妇科、内科以及摄生等多个范畴的病理机制。因而，试验室在前期研讨工作基础上[7-17]，挑选对DPPH体外抗氧化模型的影响作为点评目标，比较当归和川芎10种配比（1∶0，1∶0.176，1∶0.364，1∶0.577，1∶0.839，1∶1.192，1∶1.732，1∶2.747，1∶5.67，0∶1）与3种提取办法（水提取模仿水煮，50%醇提取模仿酒水煎煮，先水提再95%醇提近似模仿散剂）的提取液的体外抗氧化活性差异，并选用呼应曲面剖析法，研讨当归-川芎体外抗氧化相互效果与量效联系，为提醒当归-川芎药对的配伍用药规则供给试验依据。
1 资料与办法
1.1 药物与试剂 当归为伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的枯燥根，来源于甘肃岷县当归GAP栽培基地；川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的枯燥根茎，来源于四川彭州川芎GAP栽培基地，并经南京中医药大学严辉博士判定。依据呼应曲面剖析药物相互效果要求，选用Short等[18]提出的辐射（radial slices）规划，将二维坐标均匀分红9等分，即得10个归芎药对配比（1∶0，1∶0.176，1∶0.364，1∶0.577，1∶0.839，1∶1.192，1∶1.732，1∶2.747，1∶5.67，0∶1）。对归芎药对不同配比混合药材别离进行热回流水提取、热回流50%醇提取和先水提再用95%醇提，得到相应样品（W-1～W-10，A-1～A-10，WA-1～WA-10），冷藏备用。DPPH（2，2-二苯基-1-苦肼基）购自Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为剖析纯。
1.2 仪器 A-5002酶标仪（奥地利TECAN公司）；FA1104N精细天平（上海精细科学仪器有限公司）；EPED-T型超纯水器（南京易普易达科技有限公司）。
1.3 DPPH自由基铲除才能测定法 DPPH铲除率的测定[19]，在96孔板中参加不同提取办法不同配比不同浓度的归芎药对100 μL，终浓度含生药量别离为0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16 g·L-1。参加各样品受试药物后，溶于含0.1 g·L-1 DPPH的100 μL无水乙醇溶液，避光反响30 min后在517 nm波长下测定其吸光度为A0。一起作空白对照，在517 nm波长下测定其吸光度为A1。为扣除药物本底色彩对试验的影响，在参加药物后参加无水乙醇在517 nm波长下测定其吸光度A2。每个样品重复6次，依照下式核算各样品受试药物对DPPH铲除率：A1-（A0-A2）/A1×100%，并核算IC50（指DPPH的抑制率为50%时的提取物溶液浓度），IC50越小，抗氧化活性越高。
2 成果
2.1 归芎药对不同份额、不同提取办法的IC50 不同份额、不同制备办法得到的样品抗氧化才能有所不同。其间，水提液1∶1.192配比最优，1∶0，0∶1配比效果最差；醇提液1∶5.67配比最优，1∶0配比效果最差；先水提后醇提1∶5.67配比最优，1∶1.73配比效果最差，见表1。
2.2 模型参数加合构建呼应曲面 本研讨运用呼应曲面剖析法评论当归-川芎药对对DPPH自由基的抗氧化效果的药效学相互效果规则。因为中药中多成分多靶点的一起效果，本文研讨中选用二次多项式来更好的描绘两药合用的量效曲线，并以兼并指数来描绘两药的相互效果强度。为了便于绘图，将兼并指数减1，以0作为典型的加和效果。
依据成果得出不同提取办法不同配比当归-川芎的IC50，求算出UDG和UCX （UDG=当归实践用量/IC50，DG；UCX=川芎实践用量/IC50，CX），UDG +UCX=U，以U/ IC50（不同配比）为横坐标，E铲除率标明不同浓度的铲除率，以E铲除率/（1-E铲除率）为纵坐标，运用非线性回归的办法确定量效曲线的各个参数，见表1，方程为y=axb，树立三维呼应面模型，运用Matlab软件构建呼应曲面的三维图形。
2.3 当归-川芎药对相互效果的点评 在三维呼应面模型中，色彩的深浅代表了该点处2药相互效果的强度。依据兼并指数的核算办法，当指数接近于0时，提示药物间为相加效果；大于1时，提示药物间为拮抗效果，小于1时为协同效果。指数值越高，标明相互效果的强度越大，在图中表现为色彩越接近于红或蓝两头。X轴标明不同剂量浓度的U当归（U当归=当归实践用量/IC50，DG），Y轴标明不同剂量浓度的U川芎（U川芎=川芎实践用量/IC50，CX），Z轴标明归芎药对在不同剂量下的铲除率，由X，Y，Z轴构成的三维空间区域标明不同份额当归-川芎药对的效应值构成的曲面图（部分截面图中参数所代表的是U当归，U川芎，效应值强度，相互效果强度）。
2.4 归芎药对水提液的相互效果 在归芎药对水提液的呼应曲面图1中A，协同效果规模窄，简直成散点状散布，拮抗效果成条状散布，约6条，宽窄纷歧，大部分均未表现出显着协同与拮抗效果。图1中B（0.10，0.30，0.44，-1.00）的点作为协同效果最强的点，得质量浓度为0.59 g·L-1，配比为1∶1.44。图1中C（1.00，20.00，0.76，1.00）的点作为拮抗效果最强的点，得质量浓度为26.82 g·L-1，归芎配比为1∶9.56。
2.5 归芎药对醇提液的相互效果研讨 在归芎药对醇提液的呼应曲面图2中A，协同效果呈小条状散布，拮抗效果呈散点散布，而超越90%均未表现出显着协同与拮抗效果。图2中B（0.01，0.10，0.31，-1.00）的点作为协同效果最强的点，得质量浓度为0.12 g·L-1，配比为1∶2。图2中C（0.40，0.10，0.80，1.00）的点作为拮抗效果最强的点，得质量浓度为1.64 g·L-1，归芎配比为22.42∶1。
2.6 归芎药对先水提后醇提的相互效果研讨 在归芎药对先水提后醇提液的呼应曲面图3中A，协同效果呈小条状散布，有3条，拮抗效果呈散点散布，而超越50%均未表现出显着协同与拮抗效果。图3中B（0.10，1.70，0.62，-1.00）的点作为协同效果最强的点，得质量浓度为2 g·L-1，配比为1∶10.76。图3中C（0.2，0.10，0.12，1.00）的点作为拮抗效果最强的点，得质量浓度为0.45 g·L-1，归芎配比为1∶0.32。
3 评论
近年来国内外研讨标明，癌症、糖尿病、心脑血管等多种疾病与自由基导致的生物大分子氧化损害有关。自由基是人体进行生命活动时发作的一种活性分子，在正常代谢过程中，自由基的发作和铲除处于动态平衡，在某些病理状况下，这种平衡被打破，机体发作的自由基不能被及时消除，致使机体损害，导致疾病发作。DPPH在有机溶剂中是一种安稳的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大吸收峰为517 nm，当DPPH溶液中参加自由基铲除剂时，孤对电子被配对，吸收削弱或消失，其褪色程度与其承受的电子数成定量联系，可用来检测自由基的铲除状况，点评某物质的抗氧化才能。其才能用铲除率来标明，铲除率越大，标明抗氧化才能越强[20]。本试验选用DPPH法调查不同配比不同浓度不同提取办法的归芎药对立氧化才能，然后运用非线性回归的办法确定量效曲线的各个参数，树立三维呼应面模型，运用Matlab软件构建呼应曲面的三维图形。
成果显现，当归-川芎不同配比不同制法具有不同的抗氧化活性。经过剖析呼应曲面发现先水提后醇提的协同效果区域大于醇提液，水提液次之，可能是因为当归-川芎兼并先水提后醇提能使更多抗氧化成分溶出添加。
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Study on antioxidant interaction of different preparations and
proportions of Danggui-Chuanxiong drug pair
HUANG Mei-yan， TANG Yu-ping*， SHANG Er-xin， GUO Jian-ming， LIU Xin，
WANG Lin-yan， LI Wei-xia， DUAN Jin-ao
（Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae，
Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）
[Abstract] Objective： To observe the in vitro antioxidant interaction of different preparations and proportions of Danggui-Chuanxiong drug pair in the DPPH free radical scavenging rate with the response surface methodology. Method： The 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging rate method was adopted for determining the antioxidant activity of extracts from Danggui-Chuanxiong with 10 proportions and three extraction processes. The response surface methodology was used to determine the parameters of the dose-effect curve and establish a three-dimensional response surface model. The three-dimensional response surface graph was constructed with Matlab software. Result： All of the 30 samples with different proportions and preparations had antioxidant effect in scavenging free radicals and a remarkable dose-effect relationship. Their water extracts had a narrow synergistic range， with only spot distribution. Their antagonist ranges were districted in six bands of various widths. The synergistic ranges of ethanol extracts were districted in small bands， with the antagonist ranges scattered in points. The synergistic ranges of their water-alcohol extracts were distributed in three bands， with their antagonist ranges scattered in points. In short， the water-alcohol extracts showed a wider synergistic range than ethanol extracts， followed by water-extracts. All of the three extraction processes showed no obvious synergistic and antagonist effects. Conclusion： The quantitative study on the interaction of traditional Chinese medicines with different compatibilities with the response surface methodology provides reference of thoughts and methods for relevant studies.
[Key words] Danggui； Chuanxiong； drug pair； antioxidant effect； DPPH； response surface methodology； interaction
doi：10.4268/cjcmm20130218
[责任编辑 张宁宁]