脂多糖巨噬细胞敲除 塞来昔布对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型炎症因子的影响
庞逸敏+++甘露+++王献哲++苏棋+++郭哲+++何萍
[摘要]意图 树立脂多糖（LPS）誘导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，评论塞来昔布对其排泄炎症因子的影响。办法 培育小鼠RAW 264.7巨噬细胞，选用1 μg/ml的LPS影响小鼠RAW 264.7巨噬细胞24 h后，搜集细胞培育基，选用Griess法测定一氧化氮（NO）及ELISA法测定肿瘤坏死因子α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）的含量，然后树立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型。选用MTT法检测塞来昔布对LPS影响的RAW 264.7巨噬细胞的毒性效果后，选用8.00 μmol/L塞来昔布预处理细胞1 h，再参加1 μg/ml LPS影响细胞24 h，搜集细胞培育基，测定培育基中炎症因子NO、TNF-α及PGE2的含量。成果 1 μg/ml的LPS影响RAW 264.7巨噬细胞24 h后，细胞形状呈现显着变形，细胞培育基中炎症因子NO及TNF-α、PGE2含量均较正常对照组显着增高（P<0.01）。与DMSO溶剂对照组比较，8.00 μmol/L塞来昔布组能显着按捺LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的开释（均P<0.01）。定论 成功树立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，塞来昔布可显着按捺其炎症因子NO、TNF-α及PGE2的排泄。
[关键词]塞来昔布；RAW 264.7巨噬细胞；脂多糖；一氧化氮；肿瘤坏死因子α；前列腺素E2
[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（a）-0004-04
Influence of Celecoxib on inflammatory cytokines of inflammation model in RAW 264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide
PANG Yi-min1 GAN Lu1 WANG Xian-zhe1 SU Qi1
1.Department of Pharmacology，School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Department of Emergency，the Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；3.Laboratory Animal Center，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China
[Abstract]Objective To investigate the influence of Celecoxib on the secretion of inflammatory cytokines in RAW 264.7 macrophages model induced by lipopolysaccharide （LPS）.Methods Mouse RAW 264.7 macrophage was cultured.24 h after mouse RAW 264.7 macrophage was stimulated by LPS 1 μg/ml，then cell culture medium was collected.NO was tested by using Griess and the content of TNF-α and PGE2 was tested by ELISA.Then the RAW 264.7 macrophage inflammation model was established.The toxic effect of celecoxib on LPS stimulated RAW 264.7 macrophages assayed by MTT.8.00 μmol/L Celecoxib was used to pretreat cell for 1 h，following of 1 μg/ml LPS added to stimulate cell for 24 h.Cell culture medium was collected to test the content of inflammatory factors NO，TNF-α and PGE2 in culture medium.Results After 1 μg/ml of LPS stimulated RAW macrophages for 24 h，cell morphology changed obviously，the content of inflammatory factors NO，TNF-α and PGE2 in culture medium were obvious higher than those of the control group （P<0.01）.Compared with DMSO control group，8.00 μmol/L Celecoxib group could significantly inhibit the release of inflammatory cytokines NO，TNF-α and PGE2 induced by LPS in RAW 264.7 cells （P<0.01）.Conclusion Establishment of LPS induced macrophage model of RAW 264.7 and celecoxib can obvious inhibit the release of inflammatory cytokines NO，TNF-α and PGE2.
[Key words]Celecoxib；RAW 264.7 macrophage；Lipopoly-saccharide；NO；TNF-α；PGE2
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是严峻危害人类健康的常见病与多发病，也是冠心病、脑梗死、外周血管病的首要原因。近年来，AS被遍及理解为一种发作在血管壁的缓慢炎症[1]。巨噬细胞是AS炎症病理进程中的代表性细胞，巨噬细胞及巨噬细胞相关的首要生物大分子在AS的发作、开展全进程中起重要效果[2]。RAW 264.7细胞是小鼠肿瘤来历的单核/巨噬细胞系株，被细菌内毒素的首要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）影响后会开释多种过量的炎症因子，是AS研讨中常用的炎症细胞模型。
环氧合酶-2（COX-2）选择性按捺剂是现在广泛运用的非甾体类抗炎药（NSAIDs）。與传统的NSAIDs比较，COX-2选择性按捺剂在具有镇痛、抗炎效果的一起，也具有杰出的胃肠道安全性[3]。但自21世纪初以来，默克公司宣告全球自动撤回高选择性COX-2按捺剂罗非昔布的行为，引起了全球关于COX-2选择性按捺剂心血管危险的重视。很多研讨显现，关于原有心血管病疾病的患者，COX-2选择性按捺剂或许添加心肌梗死、脑卒中等严峻心脑血管方面的危险[4-6]，而COX-2选择性按捺剂对AS的效果也一直存在争议[7]。
本研讨以小鼠RAW 264.7巨噬细胞为研讨目标，选用LPS诱导其活化树立巨噬细胞炎症模型，一起调查COX-2选择性按捺剂塞来昔布（Celecoxib）对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子排泄的影响，以开始评论COX-2选择性按捺剂对AS及相关心脑血管疾病的影响及其或许机制。
1材料与办法
1.1材料
1.1.1细胞株与试剂 塞来昔布（纯度≥98%，Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；小鼠RAW264.7巨噬细胞（我国科学院上海细胞库）；DMEM高糖培育基（Hyclone公司）；胎牛血清（GemCell公司）；青链霉素混合液（100×）（北京索莱宝科技有限公司）；脂多糖（LPS L2880，Sigma公司）；MTT（Biosharp生物科技）；一氧化氮（NO）试剂盒（碧云天生物公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒（武汉博士德公司）；前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒（美国Cayman公司）。
1.1.2仪器 酶标仪（美国Molecular Devices公司）。
1.2办法
1.2.1小鼠RAW 264.7巨噬细胞的培育 将RAW 264.7巨噬细胞接种在含10%胎牛血清（<0.5 EU/ml）、1%青霉素和链霉素的高糖DMEM培育基中，置于37℃、5%CO2培育箱内培育。当细胞覆盖率到达约90%时，弃掉上清，直接参加37℃培育基吹打传代。取对数期细胞用于后续试验。
1.2.2 LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型的树立 取对数期成长的RAW 264.7细胞以每孔20×103个细胞接种于96孔细胞培育板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组和LPS模型组，每组6个复孔。正常对照组以无血清DMEM培育基孵育细胞，LPS模型组则以含1 μg/ml LPS的无血清DMEM培育基孵育细胞，孵育24 h后，调查细胞形状改动，并搜集细胞培育基测定炎症因子NO及TNF-α、PGE2含量[8]。
1.2.3 MTT法检测塞来昔布对LPS影响的RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性试验 取对数期成长的RAW 264.7细胞以每孔3×103个细胞接种于96孔细胞培育板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组、LPS模型组、塞来昔布组（塞来昔布+LPS）及DMSO溶剂对照组（DMSO+LPS），每组6个复孔。正常对照组和LPS模型组先以无血清DMEM培育基孵育细胞，塞来昔布组别离以含终浓度为40.00、30.00、10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞来昔布的无血清DMEM孵育细胞，DMSO溶剂对照组则在无血清DMEM中参加等体积DMSO孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞1 h后，除正常对照组选用无血清DMEM持续孵育外，其他各组再参加终浓度为1 μg/ml LPS影响细胞，24 h后搜集各孔培育基，在每孔中参加5 g/L MTT 10 μl，补足DMEM至100 μl（MTT终浓度为0.5 g/L），持续培育4 h后弃上清，每孔参加150 μl DMSO，震动10 min，在570 nm处丈量各孔的吸光度。
1.2.4塞来昔布对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症因子排泄的影响 取对数期成长的细胞以每孔20×103个细胞接种于96孔的细胞培育板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组、塞来昔布组（塞来昔布+LPS）及DMSO溶剂对照组（DMSO+LPS），每组6个复孔。各组处理方式同“1.2.3”，塞来昔布组仅选用8 μmol/L塞来昔布孵育细胞。以上三组别离处理完毕后，搜集细胞培育基测定炎症因子NO及TNF-α、PGE2的含量。
1.2.5 NO、TNF-α和PGE2的含量测定 按上述处理方式搜集各孔细胞培育基后，别离选用Griess法测定NO及ELISA法测定TNF-α、PGE2含量，操作参照试剂盒说明书进行。
1.3计算学剖析
选用SPSS 17.0计算软件对数据进行处理，计量材料以x±s表明，两样本均数的比较选用Student T-Test查验，多样本组间均数的比较选用One-way ANOVA查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1 LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症细胞模型的树立
效果24 h后在显微镜下进行形状学调查，正常对照组RAW 264.7巨噬细胞体积较小，呈边际亮堂的类圆形，偶有细长触角，契合巨噬细胞形状；经1 μg/ml LPS影响24 h后，细胞体积显着增大并伸出很多伪足，呈菱形、梭形、长条形等不规则形状，且细胞内有很多空泡。与正常对照组比较，LPS模型组NO及TNF-α、PGE2含量均显着增高（P<0.01）（图1、图2）。
2.2 MTT法测定塞来昔布对LPS影响的RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性试验
经MTT法检测，LPS模型组及DMSO溶剂对照组的细胞存活率与正常对照组比较，差异均无计算学含义（P>0.05）。40、30 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率较正常对照组显着下降，差异有计算学含义（P<0.01）；10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率则与正常对照组比较，差异均无计算学含义（P>0.05），且8.00 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率挨近100%，故选用8 μmol/L塞来昔布进行后续试验。
2.3塞来昔布对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子排泄的影响
与正常对照组比较，DMSO溶剂对照组炎症因子NO、TNF-α及PGE2的含量均显着增高（P<0.01）；与DMSO溶剂对照组比较，8 μmol/L塞来昔布组能显着按捺LPS誘导的RAW 264.7巨噬细胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的排泄（均P<0.01）。
3评论
炎症反响是多细胞因子经过调理促炎和抗炎体系之间的平衡而参加炎症发作、开展的进程。现在，在体外细胞炎症模型制造中，LPS是最首要、效果最强的促炎手法。LPS是革兰阴性杆菌细胞壁外膜的首要组分，能诱导活化炎症细胞引起炎症反响，然后导致多种促炎性细胞因子的发作，促炎性细胞因子的排泄可诱导炎性细胞的进一步激活，然后导致过度或失控的炎症反响，终究引起安排器官的炎性病理损害。
AS具有缓慢炎症反响特征的病理进程，其开展一直随同炎症反响。单核/巨噬细胞是AS炎症反响的重要效应细胞，一方面，巨噬细胞发作多种炎性细胞因子，促进血栓构成，扩展斑块面积，添加斑块的不稳定性，在AS病理进程中发挥关键效果；另一方面，巨噬细胞也可发作如白细胞介素-10（IL-10）、转化成长因子-β（TGF-β）等抗炎因子，添加AS斑块的稳定性，进而起维护效果[9]。
炎症因子TNF-α、NO及PGE2作为经典的急性炎症前期细胞因子，常用于衡量炎症模型成功与否的规范[10-11]。其间，TNF-α是巨噬细胞在炎症反响中发作的首要促炎细胞因子，在机体中可影响包含细胞增殖、分解及凋亡等一系列细胞功用的调理，其表达添加还可促进氧自由基的发作导致内皮功用紊乱，是AS进程中非常重要炎性因子[12]。NO是一种有重要生物学含义的无机小分子，具有杀灭细菌等病原体微生物活化巨噬细胞的效果[13]，可以介导炎症反响。NO由一氧化氮合酶（NOS）经一系列氧化复原反响生成，在动脉粥样硬化滋润的巨噬细胞中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达增高，由iNOS衍生的过量NO诱导的硝化应激会引起过度炎症反响，加剧动脉粥样硬化[14]。PGE2是COX-2的首要代谢产品，COX是催化花生四烯酸（AA）组成各种内源性前列腺素（PGs）和血栓素（TXs）的限速酶。COX首要分为COX-1和COX-2，其间COX-2酶为诱导型酶。COX-2通常被以为首要与炎症等进程中PGs的生成相关，与AS的发作开展成正相关。COX-2表达限制在粥样斑块的巨噬细胞/泡沫细胞、滑润肌细胞和内皮细胞中，在炎性要素影响下COX-2及其产品PGE2可被敏捷诱导表达，促进AS炎症反响的发作和开展[15]。本试验成果显现，1 μg/ml LPS诱导24 h后，RAW 264.7巨噬细胞发作了显着的活化的形状学改动，炎症因子NO、TNF-α及PGE2排泄水平亦较正常对照组显着上升，差异有计算学含义（P<0.01），提示已成功树立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型。
尽管较多试验发现COX-2按捺剂能减轻血管炎症、削减单核细胞滋润、改进血管壁细胞功用而推迟AS进程、添加斑块稳定性，然后削减AS血栓事情[16]，但也有COX-2按捺剂加剧AS[17]或对AS无影响[18]的报导。为评论COX-2选择性按捺剂对AS及相关心脑血管疾病的影响及或许机制，在成功树立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型基础上，本试验开始调查了COX-2选择性按捺剂塞来昔布对LPS诱导的巨噬细胞部分炎症因子排泄的影响。MTT成果显现，0.03～10.00 μmol/L的塞来昔布对LPS影响的RAW 264.7巨噬细胞无显着细胞毒性（与正常对照组比较，P<0.05）。以细胞存活率挨近100%的8.00 μmol/L塞来昔布效果于LPS影响的RAW 264.7巨噬细胞后，可显着按捺LPS诱导的RAW 246.7巨噬细胞炎症因子NO、TNF-α及PGE2的排泄。塞来昔布经过选择性按捺COX-2酶可按捺炎症因子PGE2的生成，但塞来昔布经过何种机制按捺炎症因子NO及TNF-α的生成？此外，塞来昔布在按捺NO、TNF-α及PGE2等炎症因子排泄的一起，为何却可添加AS及相关心血管事情的发作？因而，有必要在此炎症细胞模型基础上打开进一步研讨。
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（收稿日期：2017-02-24 本文修改：祁海文）