树突状细胞作业细胞 新加达原饮对缓慢乙型肝炎患者外周血树突状细胞的影响

王礼凤 宋春蓉 曹宁 齐婧 鱼绮丽 郑旭锐 惠毅

摘要：意图 调查新加达原饮对缓慢乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞（DCs）的影响。办法 对20例CHB患者均给予新加达原饮医治，阶段12周。于医治前及医治4、8、12周时搜集抗凝外周静脉血，别离扩增单个核细胞中DC，流式细胞法检测DC表型，同步检测患者丙氨酸氨基转移酶（ALT）及HBV DNA水平，并以10例健康人作为正常对照。成果 与正常对照组比较，CHB患者外周血DCs外表CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR表达显着下降（P<0.01）。经新加达原饮医治后，DCs外表分子表达水均匀进步，在医治12周时最显着（P<0.01）。与医治前比较，CHB患者医治后ALT升高，于医治8周时最显着（P<0.01），医治12周时显着下降（P<0.01）；HBV-DNA水平下降，医治12周时下降最显着（P<0.01）。定论 CHB患者外周血DCs外表分子表达水平低下，新加达原饮能上调DC表型表达。

关键词：缓慢乙型肝炎；新加达原饮；树突状细胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.007

中图分类号：R259.126.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0024-04

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的，以肝脏炎性病变为主的一种传染性疾

基金项目：陕西省中医管理局中医药科研课题（13-LC074）

病，宿主免疫状况是决议乙型肝炎临床转归和效果的最首要要素[1]。近年来国内外研讨提示，构成缓慢乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）感染缓慢化的机制与机体内树突状细胞（DCs）抗原递呈功用缺点，不能把病毒抗原的信号传递给机体的免疫系统有关[2-6]。新加达原饮是在明代医家吴又可创建的达原饮基础上，经过长时刻临床实践加减改变组成的经验方，对CHB具有较好医治效果[7-9]。本研讨以3个月为1个阶段，调查其对CHB患者外周血DCs的影响。现报导如下。

1 临床材料

1.1 一般材料

20例均为2013年7月-2014年12月陕西中医药大学榜首隶属医院门诊患者。其间男14例，女6例，年纪20～54岁，均匀年纪（32.4±10.2）岁，病程2～21年。另以10例健康人作为正常对照，均为陕西中医药大学榜首隶属医院员工。本研讨经医学道德委员会同意。

1.2 确诊规范

CHB确诊根据2010年中华医学会感患病学分会、肝病学分会联合拟定的《缓慢乙型肝炎防治攻略》的确诊规范[10]。

1.3 归入规范

契合上述CHB确诊规范，半年内未服用任何抗病毒药物和免疫调节剂医治，且不归于扫除规范任何一项的病例。

1.4 扫除规范

血清胆红素≥34.2 ?mol/L；ALT>400 U/L；血清白蛋白≤30 g/L；堆叠感染其他肝炎病毒（如甲、丙、丁、戊型肝炎病毒等），兼并肝硬化、肝癌、脂肪肝；兼并心脑、肺、肾等器质性疾病及造血系统严峻疾病、精神病患者；年纪>65岁或<18岁妊娠或哺乳期妇女；未按规则服药者。

2 办法

2.1 医治药物

一切患者均服用新加达原饮散剂（草果6 g，槟榔10 g，黄芩15 g，白芍12 g，厚朴10 g，柴胡15 g，丹参20 g，姜黄10 g，叶下珠15 g，僵蚕10 g，蝉蜕10 g，灵芝10 g等，药物饮片均购自北京同仁堂，经陕西中医药大学制药厂净化烘焙处理后，制成散剂），5 g，口服，每日3次。接连医治12周为1个阶段。医治期间制止服用任何其他抗病毒药物和保肝降酶药物。

2.2 首要试剂

淋巴细胞别离液，上海博升公司，批号20140506；重组人白细胞介素4（rh IL-4），美国Peprotech公司，批号20131103；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF），美国 Peprotech公司，批号20131217；RPMI-1640，吉诺生物医药技能有限公司；10%胎牛血清（fetal calf serum，FCS），美国Hyclone公司，批号20140123；荧光符号鼠抗人HLA-DR-PE（藻红蛋白荧光素，批号20131220）、CD80-FITC（异硫氰酸荧光素，批号20131125）、CD86-PE（批号20131214）、CD1a-FITC（批号20140210），美国 ebioscience公司；磷酸盐缓冲液（PBS），江苏宝莱公司，批号20140312；噻唑兰（MTT，批号20131015）、二甲基亚砜（DMSO，批号20130925），美国Sigma公司。

2.3 调查目标

于医治前及医治4、8、12周时，检测患者肝功用目标丙氨酸氨基转移酶（ALT），荧光PCR法检测HBV-DNA水平，流式细胞仪检测CD80、CD86、HLA-DR、CD-1α。

2.4 树突状细胞培育及表型检测

参照Romani等[11]别离培育DCs的办法稍作修正。无菌条件下抽取人外周血20 mL，肝素抗凝，用淋巴细胞别离液别离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），PBS洗刷2次，RPMI1640洗刷1次。用含10% FCS RPMI 1640液调整外周血PBMCs浓度为3×106/mL，移植入6孔培育板，每孔3 mL。37 ℃、5%CO2条件下培育2 h，吸弃培育上清液，37 ℃预热RPMI 1640液悄悄洗刷培育板2次，去除非贴壁细胞，即取得贴壁的单个核细胞。向去除非贴壁细胞的6孔培育板每孔内各加10% FCS RPMI 1640培育液3 mL，其间含有GM-CSF 100 ?g/L、IL-4 500 U/mL，在37 ℃、5%CO2条件下培育，隔日换液1次，吸弃原液1.5 mL，加同系统培育液1.5 mL。搜集第7日悬浮细胞，即为DCs，用PBS洗细胞2次，稀释成5×105/ml，参加鼠抗人CD80-FITC、CD86-PE、HLA-DR-PE、CD-1α-FITC各20 ?L，悄悄混匀，4 ℃温育45 min，再用PBS洗2次，流式细胞仪检测DCs的表达。

2.5 计算学办法

选用SPSS12.0计算软件进行剖析。计量材料用 —x±s标明，组间均数比较选用方差剖析，医治前后均数比较选用t查验。P<0.05标明差异有计算学含义。

3 成果

3.1 医治前后患者肝功用及乙型肝炎病毒DNA比较

医治过程中，CHB患者ALT一度升高，于医治8周时升高显着，但随医治时刻延伸逐步下降，于医治12周时底子康复正常。医治后患者HBV-DNA水平下降。成果见表1。

3.2 正常对照组与缓慢乙型肝炎患者医治前后树突状细胞表型表达比较

与正常对照组比较，CHB患者组外周血DCs外表CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表达水平显着下降（P<0.01）。给予新加达原饮医治后，CHB患者组外周血DCs外表CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表达水均匀升高，且在医治12周时最显着（P<0.01）。成果见表2。

4 评论

DC是起源于骨髓的专职抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），具有发动T细胞介导的免疫应对功用，其功用状况直接影响细胞和体液免疫应对。DC也是仅有可激活初始型免疫反响的细胞，是最强壮的次级免疫反响的诱导物，是免疫应对的始动者。研讨标明，CHB患者存在DC功用缺点。HBV及其抗原可构成DC数量、表型和功用的反常[5，12]。CHB患者体内DC细胞功用缺点，使HBV病毒粒子和抗原成分直接按捺DC细胞的表型老练和功用活化，从而使DC细胞不能有用递呈HBV抗原给T淋巴细胞[13]。对缓慢HBV感染者的研讨也发现，感染者外周血DC外表的CD1α、HLA-DR、CD80和CD86的表达水平低于健康者[14]。

中医关于CHB发病机制正邪联系的论说，与现代医学关于HBV感染构成机体免疫功用危害，致病毒继续不能得到铲除以使乙肝缓慢化乃至导致肝硬化、肝癌发作的机制不约而同。中医以为HBV属外感邪气，从HBV引起急缓慢肝炎的临床体现来看，HBV一起具有湿、热、毒邪的特色。HBV侵略人体后，湿热疫毒之邪蕴结中焦，影响肝胆脾胃的正常生理功用，致使脾胃失健、肝郁气滞。日久邪气结而不去，由气入血，病久入肾，构成瘀血内停，肝脾肾亏本。脾为后天之本，肾为先天之本，是人体正气的源泉和底子。HBV感染后真假搀杂，湿、热、毒、瘀互结，邪盛不断伤正，正虚不能驱邪外出，构成恶性循环，遂致病况拖延难愈。新加达原饮正是根据这样的病因病机知道创建的有用丹方，一直坚持扶正以助祛邪，祛邪不忘扶正，全面激起机体免疫应对发挥抗病毒效果。本研讨发现，与正常对照组比较，CHB患者外周血DCs外表CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表达显着下降，经新加达原饮医治3个月，能够使患者DCs外表分子表达水平显着进步。

研讨中咱们还调查到，20例患者中有5例在开端医治时无任何症状，具有不同程度消化道症状者12例，仅感腰部酸困、失眠者3例。医治4周时，腰酸及失眠者症状消失，其他患者症状改进不显着。在医治8周时，有8例患者诉纳差加剧，但跟着医治时刻的延伸，症状逐步减轻；本来5例无症状患者中有4例在医治4周时呈现大便溏、轻度腹胀，在医治8周时症状显着，跟着医治时刻的延伸，症状减轻，至12周阶段完毕，一切患者症状底子消失。患者肝功用目标（ALT）在开端医治后均升高，但病毒水平并未呈现相应添加，而是继续下降；跟着医治时刻的延伸，ALT逐步康复正常，此刻病毒量进一步下降。在这一过程中并未添加任何保肝办法，由此估测，药物经过上调DCs的功用，激起机体免疫应对，增强了机体正气祛邪外出的才能，从而使湿热伏邪不断透出，引起或加剧腹胀、便溏、纳差等症状体现；一起发挥了抗病毒的效果，进而使肝细胞在病毒铲除过程中暂时遭到危害而致肝功用反常。

总归，新加达原饮能够经过增强DCs的功用而发挥抗HBV的效果，能够用于CHB的医治。本研讨因为经费有限，调查周期较短，尚无法全面提醒其抗病毒机制。在经过激起免疫应对彻底铲除乙肝病毒这一医治过程中，免疫铲除的重要标志——转氨酶升高[15]是判别效果和预后的重要目标。怎么操控肝功用的反常程度即ALT升高的水平，才愈加有利于抗病毒，取得彻底应对，还需要更多的研讨来断定，以避免发作肝功用失代偿现象。

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