大鼠行为学 橙皮苷对缓慢应激郁闷模型大鼠行为学及HPA轴的影响
蔡莉，李荣，吴清清，吴婷妮
[摘要] 意图：调查橙皮苷对缓慢应激郁闷模型大鼠行为学及下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的影响。办法：选用缓慢轻度不行预见性应激（CUMS）制备大鼠郁闷模型，60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、橙皮苷（40， 80， 160 mg·kg-1）组及阳性药氟西汀（10 mg·kg-1）组。接连灌胃给药3周，糖水偏心试验和逼迫游水试验测定动物行为学，检测血清皮质酮（CORT）、肾上腺指数、下丘脑促肾上腺皮质激素开释激素（CRF） mRNA以及下丘脑室旁核糖皮质激素受体（GR）蛋白，评论橙皮苷的抗郁闷效果及机制。成果：与模型组比较，橙皮苷（40， 80， 160 mg·kg-1）医治组大鼠的糖水消耗量均显着添加、逼迫游水不动时刻有不同程度的削减。一起，橙皮苷能反转CUMS大鼠过高的血清CORT水平缓肾上腺指数，并能按捺CUMS大鼠下丘脑CRF mRNA表达、上调室旁核GR蛋白表达。定论：橙皮苷能有用改进CUMS大鼠行为学，表现出抗郁闷效果，其机制或许与调理HPA轴的功用有关。
[要害词] 橙皮苷；缓慢轻度不行预见性应激；抗郁闷；下丘脑-垂体-肾上腺轴
郁闷症是一种常见的损害人类身心健康的情感妨碍性精神疾病，其患病率估计到2020年将跃升到第2位[1]，而从天然植物和中药丹方中寻觅安全、高效的抗郁闷药物，已成为抗郁闷研讨的重要方向之一[2-3]。橙皮苷为二氢黄酮类化合物，广泛存在于柑桔属植物如橙、柚、桔等，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗风湿等药理效果。研讨证明，柑橘类生果的香味能下降逼迫游水试验大鼠不动时刻，该效果与调控5-HT和多巴胺的功用密切相关[4-5]；从柑橘类植物中别离得到的黄酮类化合物芹菜素，已被证明具有抗郁闷活性[6]，提示从柑橘属植物中或许寻觅到具有抗郁闷活性的天然化合物；此外，在具有抗郁闷效果的药用植物Byrsonima crassifolia和中药复方香苏散（日本称Koso-san）的有用成分中均含有橙皮苷[7-8]，但橙皮苷自身是否具有抗郁闷活性迄今未见报导。本研讨选用缓慢轻度不行预见性应激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）所形成的郁闷症大鼠为试验模型，调查橙皮苷长时刻给药对CUMS大鼠行为学的影响，并评论橙皮苷对下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal， HPA）轴的调理效果，以说明其或许的抗郁闷效果及内涵机制。
1 资料
1.1 动物 雄性SD大鼠，体重（180±20） g，安徽医科大学试验动物中心供给，合格证号皖动准字01号。
1.2 药物与试剂 橙皮苷（纯度>98%）从陈皮中别离、纯化；氟西汀（北京诺华制药有限公司）；橙皮苷和氟西汀临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成相应浓度。皮质酮（corticosterone， CORT） ELISA试剂盒（RapidBio公司）；Trizol （Invitrogen公司）；反转录试剂盒（Fermentas公司）；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（Applied Biosystems公司）；促肾上腺皮质激素开释激素（corticotropin release factor， CRF）引物（上海生物工程技术服务有限公司）；糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor， GR）兔抗多克隆抗体、SP-9000免疫组化试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司）。
1.3 仪器 BP211D型电子天平（德国Sartarius公司）；MK3型全自动酶标仪（荷兰雷勃公司）；ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；Nikon 80i型荧光显微镜（日本尼康公司）。
2 办法
2.1 动物分组与给药计划 60只大鼠习惯养殖1周，随机分为正常组、CUMS模型组、橙皮苷低、中、高剂量组（40，80，160 mg·kg-1）及阳性药氟西汀组（10 mg·kg-1），每组10只。于CUMS造模一起，各组动物灌胃给药，每日1次，接连21 d，正常组及模型组给予同体积的0.5%羧甲基纤维素钠。
2.2 CUMS郁闷模型的树立 正常组每笼5只养殖，无任何影响，其他组单笼养殖，按下列应激程序制备缓慢应激郁闷模型[9]：5 min冷水游水（8 ℃）、24 h断食断水、24 h歪斜鼠笼（45°）、30 min温水游水（30 ℃）、湿润鼠笼过夜、拥堵鼠笼过夜、20 min水平摇晃，以上影响随机安排，每日1种，同种影响不能接连呈现，接连给予21 d应激，形成大鼠缓慢应激郁闷模型。
2.3 糖水偏心试验 大鼠于试验前24 h被练习习惯含糖饮水，在禁食禁水12 h后进行测验，一起给予每只大鼠称量好的1瓶2%蔗糖溶液和1瓶纯水，4 h后丈量糖水和纯水消耗量，核算糖水偏心即糖水消耗量占总液体消耗量的百分比。
2.4 逼迫游水试验 逼迫游水试验在缓慢应激3周后进行，将大鼠放于盛有高35 cm水（30 ℃）的通明圆柱形容器（高60 cm，直径30 cm ）中被逼游水。先进行15 min预游水（预游水作为应激原对大鼠下次游水时进入失望状况起诱导效果），24 h后再进行5 min正式游水试验，记载大鼠5 min内不动时刻。每只大鼠独自测验，按预先规划次序安排游水测验，确保各组间测验时刻无偏倚。
2.5 血清CORT水平缓肾上腺指数的检测 末次试验后，称量大鼠体重并断头处死，搜集全血，静置30 min后离心取上清，按ELISA试剂盒说明书检测CORT水平。一起敏捷别离并取出大鼠双侧肾上腺安排，称重并核算肾上腺指数=肾上腺质量（mg）/体重（g）×100%。
2.6 实时定量PCR（Q-PCR）检测下丘脑CRF mRNA表达 别离大鼠下丘脑安排，Trizol法提取总RNA并进行反转录，Q-PCR选用SYBR Green染料法，反响条件： 50 ℃ 2 min； 95 ℃ 10 min； 40个循环（95 ℃ 15 s； 64 ℃ 60 s）。引物序列：CRF sense 5′-CAGAACAACAGTGCGGGCTCA-3′， antisense 5′-AAGGCAGACAGGGCGACAGAG-3′； β-actin sense 5′-TTGCTGACAGGATGCAGAA-3′， antisense 5′-ACCAATCCACACAGAGTACTT-3′。意图基因mRNA的相对表达量依据2-ΔΔCt的公式及办法进行换算。
2.7 免疫组化法检测下丘脑室旁核GR的表达 按免疫组化试剂盒说明书进行，用PBS替代一抗作为阴性对照。详细如下：下丘脑安排白腊切片惯例脱蜡至水，高压抗原修正，3% H2O2灭活内源性酶，山羊血清关闭20 min，滴加一抗后4 ℃过夜，滴加二抗后37 ℃孵育15 min，DAB显色，脱水，通明，封片。选用南京大学捷达公司JD801型病理图画剖析体系进行图画剖析，每只大鼠挑选3张切片进行调查，对每张切片的2个阳性表达区域别离核算一切染色的均匀吸光度，以3张切片的均值进行半定量剖析。
2.8 统计学办法 选用SPSS 11.5软件进行剖析，数据成果以±s标明，组间比较选用One-Way ANOVA查验，P<0.05标明差异有统计学含义。
3 成果
3.1 橙皮苷对CUMS大鼠糖水消耗量的影响 别离在应激第1天和第21天测定大鼠糖水偏心，成果见表1。在第1天，各组大鼠的糖水偏好并无显着性差异。在第21天，与正常组比较，经长时刻缓慢应激后，模型组大鼠的糖水偏心显着性下降；与模型组比较，CUMS大鼠给予橙皮苷3周后，各剂量橙皮苷均能显着进步CUMS大鼠低下的糖水偏心水平；阳性对照药氟西汀也能显着进步CUMS大鼠的糖水偏心。
3.2 橙皮苷对CUMS大鼠逼迫游水不动时刻的影响 在逼迫游水试验中，与正常组比较，长时刻缓慢应激能延伸模型组大鼠逼迫游水不动时刻，并具有显着性差异。与模型组比较，橙皮苷（80，160 mg·kg-1）灌胃给药能显着下降CUMS大鼠不动时刻（P<0.01），氟西汀组大鼠的不动时刻也显着少于模型组大鼠，见图1。
3.3 橙皮苷对CUMS大鼠CORT血清浓度的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清CORT含量显着升高（P<0.01）；与模型组比较，橙皮苷能剂量依靠性地下降CUMS大鼠血清中CORT的水平，阳性对照药氟西汀也发作相同的按捺效果，而且橙皮苷（80，160 mg·kg-1）组和氟西汀组有显着性差异，见表2。
3.4 橙皮苷对CUMS大鼠肾上腺指数的影响 与正常组比较，模型组大鼠的肾上腺指数显着性升高。与模型组比较，橙皮苷（160 mg·kg-1）对CUMS大鼠过高的肾上腺指数具有显着的按捺效果，氟西汀也表现出显着的按捺效果，见图2。
3.5 橙皮苷对CUMS大鼠下丘脑CRF mRNA表达水平的影响 Q-PCR成果标明，与正常组比较，模型组大鼠下丘脑CRF mRNA表达显着增多；与模型组比较，CUMS大鼠经橙皮苷和氟西汀医治后，其下丘脑CRF mRNA表达水平有不同程度的下降，橙皮苷（80，160 mg·kg-1） 组和氟西汀组有显着性差异，见图3。
3.6 橙皮苷对CUMS大鼠下丘脑室旁核GR蛋白表达的影响 免疫组化法检测大鼠下丘脑室旁核GR蛋白表达状况，光镜下可见GR阳性细胞的胞核呈现棕黄色颗粒，各组切片可见不同数目和强度的GR染色阳性表达细胞。半定量剖析成果标明，与正常组比较，模型组大鼠下丘脑室旁核GR蛋白表达显着削减。与模型组比较，橙皮苷（80，160 mg·kg-1）和氟西汀（10 mg·kg-1）均可以显着添加CUMS大鼠下丘脑室旁核GR蛋白的表达，见表3。
4 评论
郁闷症患者的临床症状表现为活动力下降、爱好损失及胃口下降等。CUMS郁闷模型经过随机给予不同的低强度应激因子长时刻影响动物，模仿人类缓慢低水平应激源导致的郁闷症，该模型与郁闷症患者的临床表现有必定程度的类似性，被广泛用于抗郁闷药的活性挑选和发病机制的评论[10]。行为学试验在点评药物是否具有抗郁闷活性方面发挥重要效果。本研讨标明，CUMS模型组大鼠的糖水偏心显着下降，糖水偏心下降是衡量快感缺少的有用客观目标[11]，与郁闷症患者爱好减低的症状类似，给予橙皮苷医治后能显着添加CUMS大鼠的糖水偏心。逼迫游水试验经过调查动物在不行躲避性应激状况下，因失望致不动时刻的改动反映药物的抗郁闷效应[12]。本研讨发现CUMS模型组大鼠逼迫游水的不动时刻显着添加，长时刻给予橙皮苷干预后，能削减CUMS大鼠的逼迫游水试验不动时刻。上述行为学研讨成果标明，橙皮苷对CUMS郁闷模型大鼠具有必定的医治效果。
应激影响引起机体发作一系列相应的生理和行为改动，即“应激反响”。应激反响最重要的特征是HPA轴活化及由此发作的糖皮质激素（动物表现为CORT）很多开释[13]。重复的HPA轴反常激活与郁闷症的发作、开展密切相关，有研讨标明郁闷症患者血浆皮质醇水平显着升高、脑垂体和肾上腺显着肥壮[14]。本研讨发现，作为点评CUMS对HPA轴功用影响的重要目标，模型组大鼠血清CORT浓度显着升高、肾上腺指数显着上升，而CUMS大鼠经橙皮苷长时刻给药医治后，橙皮苷医治组大鼠的血清CORT和肾上腺指数均呈现不同程度的翻转，与CUMS大鼠郁闷行为的改进同步。
作为HPA轴活性调理的起点，CRF是HPA轴的要害中枢驱动力，在应激反响中起重要效果[15]。来自下丘脑的CRF影响腺垂体开释促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone， ACTH），促进肾上腺排泄糖皮质激素。生理状况下，过度升高的糖皮质激素经过负反馈调理按捺ACTH，CRF的组成，保持糖皮质激素相对安稳和适度的应激反响。糖皮质激素的负反馈调理由糖皮质激素受体GR介导完成，GR结合配体后进入胞核，特异性结合CRF基因启动子内的负性糖皮质激素反响元件（nGRE），按捺下丘脑CRF的基因表达[16]。研讨证明，郁闷症患者下丘脑GR的活性和对配体的敏感性均下降，存在显着的HPA轴负反馈调理机制受损现象，终究引起HPA轴超敏[17]。在本研讨中，模型组大鼠下丘脑CRF mRNA表达显着升高、下丘脑室旁核GR蛋白表达显着下降，标明模型组大鼠存在CRF功用亢进、GR功用低下，橙皮苷灌胃给药对CUMS大鼠下丘脑CRF mRNA及GR蛋白的反常表达均有必定的改进效果，标明橙皮苷可以经过添加下丘脑室旁核GR的表达，康复糖皮质激素的负反馈调理效果，下调反常活化的下丘脑CRF的功用，进而保持HPA轴的稳态。
综上所述，橙皮苷可以有用改进CUMS模型大鼠的郁闷样行为，具有抗郁闷效果，其或许机制为按捺CUMS大鼠HPA轴的亢进、调理HPA轴的功用状况。
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Effect of hesperidin on behavior and HPA axis of rat model of
chronic stress-induced depression
CAI Li1， LI Rong2*， WU Qing-qing2， WU Ting-ni2
（1. Department of Pathology， Anhui Medical University， Hefei 230032， China；
2. College of Pharmacy， Anhui Medical University， Hefei 230032， China）
[Abstract] Objective： To observe the effect of hesperidin on behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal （HPA） axis of rat model of chronic stress-induced depression. Method： Chronic unpredictable mild stress （CUMS） was used to establish the rat depression model. Sixty male SD rats were divided randomly into six groups： the normal group， the model group， the hesperidin （40， 80， 160 mg·kg-1） group and the positive fluoxetine （10 mg·kg-1） group. They were orally administered with drugs for three weeks. The sucrose preference test and the forced swimming test （FST） were assayed to detect animal behavior. The levels of corticosterone （CORT） in serum， mRNA of corticotropin release factor （CRF） in hypothalamus as well as protein expression of glucocorticoid receptor （GR） in paraventricular nucleus （PVN） were determined to clarify the anti-depression effect and mechanism of hesperidin. Result： Compared with the model group， rats in the hesperidin （40， 80， 160 mg·kg-1） treatment group showed significant increase in the sucrose consumption and decrease in the immobility time in FST to varying degrees. Meanwhile， the excessively high serum CORT and adrenal index of CUMS rats were reversed by treatment with hesperidin. In addition， hesperidin inhibited CRF mRNA expression in hypothalamus and up-regulated GR protein expression in PVN among CUMS rats. Conclusion： Hesperidin could effectively improve the behavior of CUMS rats and show the anti-depression effet. Its mechanisms may be related to the function of regulating HPA axis.
[Key words] hesperidin； chronic unpredictable mild stress； antidepressant； hypothalamic-pituitary-adrenal axis
doi：10.4268/cjcmm20130217
[责任编辑 张宁宁]