丹参 丹参毛状根的诱导及培育条件的优化

谈荣慧+张金家+赵淑娟

[收稿日期] 2013-12-29

[基金项目] 上海市教委预算内课题（2010JW20）

[通讯作者] *赵淑娟，Tel：（021）51322576，E-mail： zhaoshujuan@126.com

[作者简介] 谈荣慧，助理研讨员，硕士，Tel：（021）51322495，E-mail：tanronghui405@126.com

[摘要] 为了树立丹参毛状根的诱导办法及液体培育系统，以发根农杆菌A4，LBA9402，15834为实验菌株别离侵染丹参无菌苗叶片，诱导丹参毛状根，PCR扩增挑选阳性株系，HPLC测定丹酚酸含量并在此根底上进一步优化毛状根的液体培育条件。效果显现：3种发根农杆菌A4，LBA9402，15834均诱导出丹参毛状根，经PCR判定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中，其间发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高，质量分数别离为（3.27±0.37）%，（3.17±0.20）%；由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培育基培育的丹参毛状根丹酚酸含量较高，质量分数为（4.56±0.36）%；由发根农杆菌LBA9402诱导，pH为4.81的MSOH液体培育基培育的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。因而，以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培育基中培育的丹酚酸含量较高。为进一步运用基因工程技能改进中药丹参的质量奠定了根底。

[关键词] 丹参毛状根；发根农杆菌；丹酚酸；HPLC

中药丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的枯燥根或根茎，具有祛瘀止痛、养血安神的成效^[1]。现代药理研讨标明丹参对医治心血管系统和血液系统的疾病有显着的效果，现已广泛运用临床^[2]，其药效物质根底主要是脂溶性二萜醌类成分和水溶性酚酸类成分^[3]。

因为丹参有效成分在原植物根中含量低、成长周期长，在传统的培育形式下又面临着质量严峻退化、农药残留及占用很多犁地资源等问题，运用基因工程的手法对丹参质量进行遗传改进是一条抱负的途径。由发根农杆菌感染植物构成的丹参毛状根系统，成长速度较快，遗传性安稳，成为出产丹参药理活性物质尤其是水溶性酚酸类成分的杰出培育系统^[4]。现在，国内外环绕丹参毛状根的研讨作业已有一些效果^[5-9]，可是关于经过优化丹参毛状根的诱导及培育条件来取得高含量有效成分尚无报导。本文对影响丹参毛状根有效成分的多种要素进行了研讨，为丹参的遗传改进作业奠定了根底。

1 资料

丹参无菌苗（1/2MS固体培育基培育）取自本实验室，发根农杆菌菌株A4，LBA9402，15834由本实验室供给。1/2MS培育基是指在MS培育基的根底上除蔗糖外其他成分均折半，MSOH培育基是指在MS培育基的根底上由1 g·L-1水解酪蛋白代替NH4NO3。

Agilent 1260高效液相色谱仪冷，冻枯燥机（美国Labconco公司），电子天平（Sartorius公司），丹酚酸B对照品（上海融禾医药科技发展有限公司，批号100429），迷迭香酸对照品（上海中医药大学规范化中心，纯度99.07%），乙腈（色谱纯，Fisher公司），其他试剂为剖析纯，高纯水为本科室克己。

2 办法

2.1 发根农杆菌对丹参毛状根丹酚酸含量影响

2.1.1 发根农杆菌的培育与活化 发根农杆菌菌株为A4，LBA9402，15834。无菌条件下，接种针挑取保种菌液，于YMB固体培育基（含利福平50 mg·L-1，琼脂质量浓度10 g·L-1，pH 7.0）上划线培育，28 ℃暗室培育直至长出单菌落。挑取单菌落转入3 mL YMB液体培育基（含利福平50 mg·L -1）中，28 ℃，220 r·min-1震动暗培育，至YMB液体培育基由接种前通明的暗红色变为污浊的淡黄色，按1%转入新制造的无抗生素的30 mL YMB液体培育基中，28 ℃，220 r·min-1震动暗培育，至A600为0.5。

2.1.2 丹参毛状根的诱导 从丹参无菌苗上取下稚嫩叶片，将叶片剪成1 cm2巨细的叶盘；将上述菌液稀释2倍做侵染，将叶盘放入农杆菌悬液中浸5 min后，无菌滤纸吸去叶盘上剩余的农杆菌，叶盘反面向上放在MSOH培育基上，用封口膜封上。25 ℃暗培育2 d，然后将叶盘以相同的方向转至含有500 mg·L-1凯福隆的脱菌MSOH固体培育基上，用封口膜封上后25 ℃暗培育。2周左右，在叶盘切断周围长出毛状根。待毛状根成长到2 cm左右时剪下转移到含有500 mg·L-1凯福隆的MSOH固体培育基中培育；3～4周后将毛状根转移到含有250 mg·L-1凯福隆的MSOH固体培育基中培育；2～3周后可转移到不含抗生素的MSOH液体培育基中培育。除菌彻底的毛状根在无抗生素的MSOH液体培育基上继代培育，每21 d转接1次。

2.1.3 丹参毛状根rolB基因和rolC基因的PCR检测 将转接约3代的丹参毛状根搜集资料，CTAB法提取各毛状根株系及未转化的丹参无菌苗的基因组DNA。另各取200 μL活化的发根农杆菌A4，LBA9402，15834菌液，12 000 r·min-1离心2 min，去上清，20 μL ddH2O悬浮，沸水煮5 min，12 000 r·min -1离心2 min，上清作为模板。上海赛百盛生物技能有限公司组成rolB基因和rolC基因的PCR引物， rolB-F：5′-CTTATGACAAACTCATAGATAAAGGTT-3′，rolB-R： 5′-TCGTAACTATCCAACTCACATCAC-3′；rolC-F： 5′-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3′，rolC-R： 5′-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3′。PCR反响系统：在20 μL PCR反响液中，别离参加rolB基因和rolC基因的上、下流引物各0.5 μL（终浓度25 pmol·L-1），模板DNA 2 μL（约50 ng）。PCR反响条件及进程：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s；72 ℃复性45 s （2～4步30个循环），72 ℃延伸10 min，4 ℃恒温保存。各取10 μL rolB基因和rolC基因的PCR扩增产品进行1.0%琼脂糖凝胶电泳和摄影，100 bp Ladder和1 kbp Ladder作为分子量规范。预期产品巨细rolB基因和rolC基因别离为862，574 bp^[10]。endprint

2.1.4 不同发根农杆菌诱导的丹参毛状根丹酚酸含量测定 经PCR判定，发根农杆菌A4，LBA9402，15834别离取得了5，10，6株丹参毛状根阳性株系。将阳性株系均以每100 mL培育基1 g（鲜重）接种，MSOH液体培育基培育21 d后收取资料。别离搜集了第4，5，6，9，10共5代资料于-80 ℃保存，冷冻枯燥机冻干，置于电子枯燥器中贮存备用。

对照品溶液的制备：精细称取丹酚酸B对照品2.4 mg，加70%甲醇和1%甲酸制成1.2 g·L-1的丹酚酸B（SAB）对照品溶液；精细称取迷迭香酸（RA）对照品1 mg，加70%甲醇和1%甲酸制成0.5 g·L-1的迷迭香酸对照品溶液。

供试品溶液的制备：样品研磨成粉，将由同种发根农杆菌诱导的相同代数的丹参毛状根粉末等量混匀。精细称取混匀粉末50 mg，精细参加70%甲醇和1%甲酸10 mL，超声40 min。每个样品重复3次。

色谱条件：CNW C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长280 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL·min-1，进样量20 μL，活动相为乙腈（A）和0.4%甲酸（B）梯度洗脱：0～40 min，A 10%～37%，B 90%～63%。

2.2 培育基对丹参毛状根丹酚酸含量影响

丹参毛状根的培育：依据2.1实验效果，任取1瓶由LBA9402诱导的丹参毛状根（记为LBA9402-1）以每100 mL培育基1 g（鲜重）别离接种到pH为5.86的MSOH，MS，B5，6，7-V 4种液体培育基中，每个样品重复3次，于120 r·min-1摇床上避光培育，21 d后收取资料，这为第1代资料，记为MSOH-1，MS-1，B5-1，6，7-V-1。以相同培育条件继代培育并搜集这4种培育基培育的第2，3，4，5，6共6代资料贮存于-80 ℃冰箱中，然后置于冷冻枯燥机中冻干，并贮存于电子枯燥器中备用。

供试品溶液的制备：样品研磨成粉，将由相同培育基培育的同代数的3瓶丹参毛状根粉末等量混匀。精细称取混匀粉末50 mg，精细参加70%甲醇和1%甲酸10 mL，超声40 min。每个样品重复3次，丹酚酸含量测定办法如2.1.4所示。

2.3 pH对丹参毛状根丹酚酸含量影响

依据2.1和2.2实验效果将由LBA9402诱导的MSOH液体培育基培育的丹参毛状根以每100 mL培育基1 g（鲜重）接种到不同pH的MSOH液体培育基中培育，每个样品重复3次，培育21 d后收取资料并于-80 ℃冰箱中保存。将搜集的一切资料放于冷冻枯燥机中冻干并置于电子枯燥器中贮存备用。

供试品溶液的制备：样品研磨成粉，将由相同pH培育的3瓶丹参毛状根粉末等量混匀。精细称取混匀粉末50 mg，精细参加70%甲醇和1%甲酸10 mL，超声40 min。每个样品重复3次，丹酚酸含量测定办法如2.1.4。

3 效果与定论

3.1 不同发根农杆菌对丹参毛状根丹酚酸含量影响

3.1.1 丹参毛状根的诱导 将发根农杆菌A4，LBA9402，15834感染后的外植体接种于MSOH培育基上培育4～5 d后，有的外植体开端膨大，在创伤处发作少数的淡黄色愈伤安排。8 d后，3种外植体都连续长出白色的毛状根，经脱菌彻底后转到无抗生素的MSOH液体培育基中培育，LBA9402诱导的丹参毛状根诱导发作进程见图1。选用A4，15834侵染时，毛状根诱导发作进程与之相似。

3.1.2 丹参毛状根阳性株系的判定 rolB基因和rolC基因是发根农杆菌Ri质粒TL-DNA与毛状根的形状发作及再生植株形状特征密切相关的基因。别离以未转化丹参无菌苗基因组DNA、发根农杆菌15834，A4，LBA9402所诱导的丹参毛状根基因组DNA及其相应的菌株Ri质粒的DNA为模板，进行PCR检测，估计扩增产品巨细rolB基因和rolC基因别离为862，574 bp。PCR检测效果标明，未转化丹参无菌苗基因组DNA中没有扩增出意图条带，转化毛状根中扩增出了预期的862，574 bp的特异片段，阳性率为100%，见图2。阐明发根农杆菌T-DNA上rolB基因和rolC基因已整合进毛状根基因组中。

3.1.3 不同发根农杆菌诱导的丹参毛状根丹酚酸含量测定 将取得的丹参毛状根阳性株系在MSOH液体培育基（水解酪蛋白1 g·L-1，pH 5.85）中培育，HPLC检测丹参毛状根的丹酚酸成分含量。

将所测得的数据用Excel软件剖析，剖析数据效果标明由发根农杆菌A4，LBA9402，15834诱导的丹参毛状根迷迭香酸和丹酚酸B含量均无显着差异，由A4，LBA9402诱导的毛状根与15834诱导的丹参毛状根总丹酚酸含量有显着差异，见图3，表1。

由图3和表1中的数据能够看出，由发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根总酚酸类化合物含量高，由15834诱导的丹参毛状根总酚酸类化合物含量最低。从成长状况上三者诱导的毛状根差异不显着。因而，这3种发根农杆菌相比较，发根农杆菌LBA9402和A4较合适诱导丹参毛状根。

3.2 培育基对丹参毛状根丹酚酸含量影响

将丹参毛状根LBA9402-1转接到不同液体培育基MSOH，MS，B5，6，7-V中培育，HPLC测定样品丹酚酸含量，主要是RA和SAB进行了含量测定，见图4。将测得的数据用Excel软件剖析，剖析数据效果标明由MSOH液体培育基培育的丹参毛状根与B5，MS，6，7-V培育基培育的丹参毛状根丹酚酸含量有显着差异，见表2。

从图4和表2的数据能够看出，由MSOH液体培育基培育的丹参毛状根RA，SAB和总丹酚酸化合物含量均最高。别的毛状根在培育进程中4种培育基培育的丹参毛状根成长状况也不尽相同，由B5，MS培育基培育的丹参毛状根繁衍率低；6，7-V培育基培育的毛状根繁衍率较高，可是毛状根比较短，成簇状；MSOH培育基培育的毛状根繁衍率最高，成长状况最好，因而，MSOH液体培育基最合适培育丹参毛状根。endprint

3.3 pH对丹参毛状根丹酚酸含量影响

依据2.1和2.2效果将由LBA9402诱导的MSOH液体培育基培育的丹参毛状根接种到不同pH的MSOH液体培育基中培育，HPLC测定各样品的丹酚酸含量见图5。

从图5的数据能够看出，MSOH液体培育基在pH≤3.99的时分不利于毛状根的丹酚酸含量的累积，当4.51≤pH≤6.01时，毛状根的丹酚酸含量较高，在pH为5.81时丹酚酸含量到达最高，阐明pH为5.81的MSOH液体培育基最合适培育丹参毛状根。毛状根在培育21 d后培育液中的4.84≤pH≤5.21，趋于相对安稳的状况。

4 评论

本实验将实验室保种的发根农杆菌15834，A4，LBA9402侵染丹参无菌苗叶片并诱导出丹参毛状根，这3种毛状根成长形状上并无差异，可是它们的水溶性酚酸类化合物含量差异比较显着，由LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高，15834诱导的丹参毛状根丹酚酸含量最低。引起这种差异的原因或许是因为发根农杆菌的致根特性与其所带Ri质粒的类型有关^[11]。杨世海等用发根农杆菌菌株LBA9402，R1601感染甘草，LBA9402比R1601表现出较强的感染力。胡萝卜和大白菜上，农杆碱型菌株比黄瓜碱型菌株致根力强^[12]。在柑橘的离体转化中，发根农杆菌A4菌株的致根力较R1000大，而15834的致根力最弱。桔梗叶片更适于承受pRi2659菌株的侵染，而pRi15834，pRiA4诱导才能较低。由此可见，植物品种不同，适用的发根农杆菌菌株也不同^[11]；需求堆集的意图化合物不同，适用的发根农杆菌也会有所不同。

在以上作业根底上，将LBA9402诱导的丹参毛状根转接到MSOH，MS，B5，6，7-V等4种不同液体培育基中培育，以MSOH液体培育基培育的丹参毛状根RA，SAB和总丹酚酸含量最高，成长状况最好，最合适培育丹参毛状根，剖析原因或许是与培育基的组成成分有关，如MSOH培育基中运用的是1 g·L-1的水解酪蛋白，而MS培育基中运用的是NH4NO3。梁明等对青蒿素的研讨也标明培育基中的氮源是影响青蒿毛状根发作青蒿素的一个非常重要的要素^[12]，沈双等对培育基中不同营养元素对丹参毛状根成长及丹参酮堆集的影响的研讨也标明NH4NO3既不利于丹参毛状根的成长，一起也不利于丹参酮类成分的堆集和开释^[13]。

此外，还将毛状根接种到不同pH的MSOH液体培育基中培育，发现MSOH液体培育基在pH为5.81时最合适培育丹参毛状根，剖析原因或许是液体培育基的pH影响锰（Mn）、铁（Fe）、铜（Cu）、钙（Ca）等矿物质元素的存在状况及其吸收代谢，还严峻影响磷酸盐的吸收。研讨标明，pH偏酸性时，DNA的组成添加，当pH上升时，DNA的组成敏捷下降，终究影响到根系对元素的吸收；pH还对在毛状根成长和代谢中起关键效果的酶的活性有影响，还或许经过影响酶和底物的解离状况而对毛状根的成长繁衍及代谢起效果^[14]。在研讨中还发现丹参毛状根在培育21 d后培育液中的4.84≤pH≤5.21，趋于相对安稳的状况。剖析原因或许是毛状根把一部分次生代谢产品开释到培育基中，因而培育液中的pH处于相对平稳的状况。杨睿等发现，水母雪莲毛状根成长及总黄酮生物组成的最适pH为5.8，过高和过低的pH都不合适水母雪莲毛状根总黄酮构成^[12]。黄花烟草发根培育物在16 d成长期内，质量进步35倍，向培育基中排泄的尼古丁高达10 g·L-1，Rhodse等在发酵罐中的培育黄花烟草的毛状根可向培育液中开释意图产品烟碱^[15]。

本研讨成功树立了丹参毛状根诱导及培育系统，并对丹参毛状根的培育条件及其次生代谢产品累积规则进行了开始研讨。该实验效果标明，由发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为5.81的MSOH液体培育基中培育时丹酚酸含量较高，为运用生物技能办法来改进丹参质量奠定根底。

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