神经元培养基 条件培养基对氧—葡萄糖掠夺诱导皮层神经元逝世的维护效果
张鹏 张鹏飞 高琛
【摘要】 意图 研讨脐带间充质干细胞源条件培育基（CM）对氧-葡萄糖掠夺（OGD）诱导皮层神经元逝世的维护效果。办法 培育 10 d的皮层神经元替换培育基为 EBSS平衡盐溶液， 后置于37℃低氧（N2∶CO2∶O2=94%∶5%∶1%）培育箱内孵育， 4 h后康复正常条件培育， 一起替换为条件培育基效果20 h，
用Hoechst33342 / PI 的染色办法检测其逝世状况。成果 原代培育的 UCMSCs 传至第三代时， 细胞形状为长梭形的纤维状， 折光性好;在培育的皮层神经元树立OGD模型， Control组细胞逝世率为（5.85%±0.41）%， OGD组细胞逝世率（35.6%±1.75）%， Control组与OGD组比较差异有统计学含义（P<0.01）， OGD模型树立成功;复氧0 h时给予脐带间充质干细胞源条件培育基， 效果24 h后， OGD+CM组细胞逝世率为（27.98±2.19）%， OGD+CM组与OGD组比较差异有统计学意義（P<0.05）， CM可使皮层神经元的逝世率下降21.40%。定论 脐带间充质干细胞源条件培育基对氧-葡萄糖掠夺诱导皮层神经元具有维护效果。
【关键词】 氧-葡萄糖掠夺模型;间充质干细胞;条件培育基;皮层神经元
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.12.120
缺血性脑卒中是因各种原因导致大脑供血缺乏， 然后引起脑安排坏死的总称， 具有发病率高、致死率高和致残率高的特色。氧-葡萄糖掠夺（Oxygen-Glucose Deprivation， OGD）模型是最常用的缺血性脑卒中的体外模型， 可以在体外很好的模仿脑卒中的病理状况。
脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， UCMSCs）来历于中胚层间充质的成体干细胞， 具有易于获取， 无伦理学争议， 增殖才能较强， 易于体表里扩增等特性， 成为临床干细胞移植的要点重视目标， 但是不管经过何种途径输入体内， 抵达靶器官的细胞数量、状况及存活时刻尚无满足的研讨证明， 而间充质干细胞在培育过程中发现其可经过旁排泄途径排泄血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor， bFGF）等很多生物活性物质[1， 2]， 近年亦有研讨报导间充质干细胞（mesenchymal stem cell， MSCs）衍生的胞外囊泡可参加细胞间传递、细胞内信号传导以及在体内短距离或长距离运送以改动细胞或安排的代谢[3]， 因而， 测验运用脐带间充质干细胞来历的条件培育基（Condition Medium， CM）进行研讨， 调查其维护神经元的效果。
现在运用细胞模型研讨条件培育基维护OGD中神经元逝世的相关研讨较少， 本试验制备脐带间充质干细胞来历条件培育基， 其间含有脐带间充质干细胞排泄的很多细胞因子成份， 在体外细胞培育模型中研讨其对神经元的维护效果， 然后为缺血性脑血管病的临床医治供应新的思路和试验根据。现陈述如下。
1 材料与办法
1. 1 脐带间充质干细胞的原代培育与条件培育基的获取
UCMSCs的原代别离培育：将无菌条件下获取的脐带安排用无菌磷酸缓冲液（PBS）冲刷屡次， 至无血迹残留;细心除掉脐带内血管与外表安排;将安排剪碎， 参加Ⅳ型胶原酶，
37℃消化17～20 h， 期间不时摇晃;再用40 ?m筛网过滤， 去除较大安排块;2000 r/min， 离心5 min， 弃去上清， 将沉积用无菌PBS清洗2～3次;1000 r/min， 离心5 min， 接种。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培育基重悬离心管中的细胞， 镜下细胞计数， 使细胞密度到达1×106个/ml， CO2培育箱培育， 换液， 将脐带间充质干细胞不断传代、纯化， 得到UCMSCs。
UCMSC-CM的搜集：纯化后的UCMSCs， 搜集每次换液的培育基， 经1500 r/min离心去除细胞碎片后， 放置在-80℃冰箱保存。
1. 2 Elisa检测条件培育基中细胞因子 向96孔板参加100 μl 1×稀释液， 作为阴性对照。一起参加所测因子的规范品100 μl到96孔板， 然后将所测样品100 μl加到96孔板， 每个样品2个微孔， 室温下避光孵育2 h。孵育完毕后向每个微孔参加200 μl酶标检测抗体， 室温下孵育2 h。然后用400 μl l×冲刷液洗刷， 最终参加200 μl显色底物（显色剂A和显色剂B各100 μl）， 室温下孵育30 min， 然后参加50 μl停止液， 用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值）， 经过规范曲线核算样品中生长因子的含量。核算神经养分因子（BDNF）、胰岛素样生长因子-I（IGF-1）、VEGF、bFGF、转化生长因子-β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、白细胞介素-6（IL-6）的浓度。每个样品重复4次， 每组取3个样品。
1. 3 OGD的构建 取培育至10 d的皮层神经元， 用无糖EBSS漂洗 1 次， 将细胞培育基置换为无糖EBSS， 原培育液留至复氧后持续运用。于缺氧孵箱（ 94% N2， 1% O2， 5% CO2， 37℃）缺氧 4 h后替换为正常培育基复氧， 持续培育20 h进行检测。
1. 4 皮层神经元逝世的检测 向OGD成功后的皮层神经元培育液内直接参加 Hoechst33342（sigma， 10 μg/ml）， 37℃效果 10 min， 再参加PI（sigma， 5 μg/ml） 37℃效果5 min ， 在荧光显微镜下调查细胞逝世状况并摄影计数。Hoechst33342 符号活细胞及凋亡前期的细胞， PI符号的为坏死细胞及凋亡晚期细胞， 细胞逝世率= PI 阳性细胞数/总细胞数×100%。
1. 5 统计学办法 选用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量材料以均数±规范差（ x-±s）标明， 选用t查验;计数材料以率（%）标明， 选用χ2查验。P<0.05标明差异有统计学含义。
2 成果
2. 1 原代培育的UCMSC-CM中细胞因子含量的检测成果
原代培育的UCMSCs 传至第三代时， 细胞形状为长梭形的纤维状， 折光性好。见图1。用Elisa法测定CM内多种细胞因子BDNF、IGF-1、VEGF、bFGF、TGF-β、HGF、IL-6的含量。见表1。从检测成果来看， CM中含丰厚的BDNF
（220.68±16.80）pg/ml、IGF-1（14.71±1.12）pg/ml、bFGF（16.27±2.89）pg/ml、VEGF（68.53±1.85）pg/ml、TGF-β（73.56±5.59）pg/ml、HGF（116.05±3.32）pg/ml、IL-6（89.48±6.27）pg/ml等多种细胞因子。
2. 2 条件培育基对OGD的皮层神经元逝世的影响 在培育的皮层神经元树立OGD 模型。见图2。Control组细胞逝世率为（5.85±0.41）%， OGD 组细胞逝世率为（35.6±1.75）%。Control组与OGD组比较差异有统计学含义（P<0.01）， OGD模型树立成功。复氧0 h时给予脐带间充质干细胞源条件培育基， 效果24 h后， 与OGD组进行比较， OGD+CM组细胞逝世率为（27.98±2.19）%， OGD+CM组与 OGD组比较差异有统计学含义（P<0.05）， CM可使皮层神经元的逝世率下降21.40%。
3 评论
跟着缺血性脑卒中发病率越来越高， 給人类健康带来了严重威胁， 迫切需要新的有用医治手法的呈现。间充质干细胞因为其体外易于获取， 无伦理学争议， 增殖才能较强， 易于体表里扩增等特性， 常被用于细胞移植的临床试验， 现在可从www.clinicaltrials.gov网站上查询到的运用间充质干细胞的临床试验有600余例。很多动物试验标明， 间充质干细胞可用于医治根据动物模型的多种疾病， 并具有很好的安全性， 间充质干细胞经过开释多种细胞因子促进内源性神经、血管的再生， 促进突触联络、髓鞘的再生， 并可按捺细胞凋亡， 调理炎症反响[4-6]。既往对间充质干细胞的研讨侧重于细胞的分解代替功用， 很少重视其旁排泄现象， 本试验选用间充质干细胞源的条件培育基效果于OGD模型中的皮层神经元， 调查其对神经元的维护效果， 以此证明条件培育基对缺血性脑卒中的医治效果， 具有必定的立异性。
很多研讨报导间充质源条件培育基对疾病模型具有与MSC相似的效果， Markovic等[7]以为MSC-CM经过按捺免疫细胞的介入然后减轻顺铂诱导的肾毒性;Shen等[8]经过很多体表里试验研讨， 标明UCMSC可排泄多种可溶性的细胞因子与趋化因子至CM中， 增强CXCR4或CCR2阳性细胞的搬迁与血管构成才能;Li等[9]以为MSC-CM可显着改进角质构成细胞的增殖与搬迁才能。缺血性脑卒中发作时， 因为血供俄然中止， 氧气、葡萄糖供应急剧下降， 使该部位脑安排崩解损坏， 兴奋性氨基酸很多开释， 神经元内钙超载， 导致神经元损害;一起， 自由基的很多发作以及与凋亡相关基因的表达和炎症反响的发作， 进一步加重神经元的损害[10-13]。
本研讨中， 运用预存的神经元培育液和适量的新鲜培育液为神经元复氧， 谷氨酸很多发作， 给予间充质干细胞源的CM后， 细胞逝世率显着下降， 标明CM对OGD模型中的皮层神经元具有明显的维护效果， 而CM中经检测含有很多的活性细胞因子， 提示CM或许经过多种活性因子的效果减轻神经元在缺血缺氧性环境中遭到一系列损害[14， 15]。当然， 其详细的效果机制仍须进一步的试验进行验证。
综上所述， 脐带间充质干细胞源条件培育基对OGD模型中的皮层神经元具有明显的维护效果， 这或许与CM 中含有多种细胞活性因子发挥维护效果有关。
参考文献
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[收稿日期：2017-12-29]