咳嗽变异性哮喘能彻底治愈 P27经过调控Bcl—2对哮喘大鼠气道平滑肌重塑的影响
徐慧 雷丹 彭燕平 戴元荣
[摘要] 意图 调查P27kip-1（以下简称P27）是否经过调控Bcl-2影响哮喘大鼠气道重塑的发作开展。 办法 SPF级雄性大鼠30只随机分红正常对照组和哮喘组，各15只。用卵白蛋白（OVA）致敏和激起的办法制备哮喘模型。调查各组大鼠肺安排病理超微结构改动，剖析支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞分类计数，并选用免疫组化法测定各组大鼠肺安排中P27、Bcl-2表达状况。 成果 哮喘组嗜酸粒细胞计数份额均显着高于对照组（P<0.01），哮喘组肺安排P27表达低于对照组（P<0.01），哮喘组肺安排Bcl-2表达高于对照组（P<0.01）。 定论 P27经过调控Bcl-2按捺气道滑润肌细胞增生进而影响气道重塑。
[要害词] 哮喘；P27；Bcl-2；气道重塑
[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0028-04
Effect of P27 on airway smooth muscle remodeling in asthmatic rats by regulating Bcl-2
XU Hui LEI Dan PENG Yanping DAI Yuanrong
Department of Respiratory Diseases， Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325027， China
[Abstract] Objective To investigate whether P27kip-1（hereinafter referred to as P27） regulates the development of airway remodeling in asthmatic rats via Bcl-2. Methods 30 SPF male rats were randomly divided into normal control group（n=15） and asthma group（n=15）. Asthma models were prepared by sensitization and challenge with ovalbumin （OVA）. The pathological and ultrastructural changes of lung tissue in each group were observed. The cell differential count in bronchoalveolar lavage fluid（BALF） was analyzed. The expressions of P27 and Bcl-2 in lung tissue of each group were detected by immunohistochemistry. Results The percentage of eosinophil count in asthma group was significantly higher than that in control group（P<0.01）. The expression of P27 in lung tissue of asthma group was lower than that in control group（P<0.01）. The expression of Bcl-2 in lung tissue of asthma group was higher than that in control group（P<0.01）. Conclusion P27 inhibits airway smooth muscle cell proliferation and thus affects airway remodeling through the regulation of Bcl-2.
[Key words] Asthma； P27； Bcl-2； Airway remodeling
支气管哮喘（哮喘）发病的病理根底为气道重塑，现在关于改善或延缓气道重塑缺少有用对策。近年来，研讨发现气道滑润肌细胞（ASMC）重塑和凋亡失衡导致了支气管哮喘的发作开展[1，2]。凋亡是在基因操控下，细胞自主、有序的逝世进程[3]。P27kip-1（以下简称P27）为细胞周期负性调理因子，分子量约27 kD，首要定坐落细胞核，经过按捺周期蛋白E-周期蛋白依靠激酶2（cyclinE-CDK2）和周期蛋白D-周期蛋白依靠激酶4（cyclinD-CDK4）等激酶复合物活性，使细胞周期阻滞在G1期，然后按捺细胞的增殖[4]。最近研讨发现P27除了发挥G1期细胞阻滞以外，还具有调理细胞凋亡的功用。凋亡的调控触及许多基因，Bcl-2作为按捺凋亡最重要的调控基因，在哮喘的发病机制中占有重要的位置[5，6]。Bcl-2宗族蛋白在线粒体凋亡途径中具有重要的调理效果，其间促凋亡蛋白，如Bax、Bid等可经过增强线粒体膜通透性，导致细胞色素C及其他促凋亡蛋白开释[7]。本研讨发现P27经过调理Bcl-2调控气道滑润肌细胞的凋亡，现报导如下。
1材料与办法
1.1 试验材料
SPF级SD雄性大鼠30只，体质量160～200 g，由温州医科大学试验动物中心供给，试验动物许可证SYXK（浙）2010～0150。兔抗鼠P27kip-1多克隆抗体（Cell Signal Technology，U.S.A），兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體（Cell Signal Technology，U.S.A），辣根过氧化物酶（HRP）符号的羊抗兔二抗（Cell Signal Technology，U.S.A），TUNEL检测试剂盒（北京中杉生物技术有限责任公司），SABC免疫组化二抗试剂盒（上海晶美生物技术有限公司），DAB显色试剂盒（上海晶美生物技术有限公司）。endprint
1.2 试验办法
1.2.1 动物模型的制备 依照随机数字表法将30只SD大鼠随机分为正常对照组（C组，n=15）和哮喘组（A组，n=15），养殖于温州医科大学试验动物中心，参阅相关文献[8]略加改善制备哮喘模型，哮喘组别离于第1天和第8天大鼠腹腔打针1 mL OVA/AL（OH）3混合液，内含1 mg OVA和100 mg Al（OH）3致敏，正常对照组用生理盐水替代。第15天开端用含1% OVA的生理盐水进行激起，每日激起哮喘1次，共6周。哮喘组大鼠体现出呼吸短促、喘息、抽搐等症状，可闻及喘鸣音，严重者呈现动作缓慢、俯卧不动、反响迟钝等症状，对照组则无此症状，大体行为上提示造模成功，造模成功后继续行安排切片调查大鼠肺安排超微结构改动。
1.2.2 各组大鼠肺安排病理超微结构的改动 各组大鼠别离于末次激起后24 h内，10%水合氯醛溶液（5 mL/kg）腹腔麻醉。切取左肺肺门中上、中下肺段安排，做白腊包埋切片，别离做HE和免疫组化。切片在HE染色后，于光镜下调查哮喘组和正常对照组的肺安排结构，是否存在上皮损害，以及调查支气管及血管周围是否存在炎症滋润。
1.2.3 细胞分类计数 BALF液离心，取沉渣用PBS重悬后滴于载玻片上涂片，晒干后用加瑞氏染液固定，再加等量缓冲液与染料混匀后进行染色，约5～10 min，再用自来水缓慢冲去染液。在高倍镜下，挑选染色杰出的区域，而且按必定次序，对200个白细胞做细胞分类计数。
1.2.4 凋亡指数的测定 高倍镜下（×400）随机取管腔直径1000 μm左右的支气管，每张切片至少调查500个支气管滑润肌细胞，核算每100个支气管滑润肌细胞中的凋亡细胞数，求得凋亡指数（AI），AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.2.5 免疫组化法检测 ASMCs上caveolin-1、p-AKT的表达 按SABC免疫安排化学染色办法检测肺安排P27、Bcl-2蛋白表达。试剂盒为上海晶美生物技术有限公司出产，按说明书操作进程进行操作，P27、Bcl-2抗体的稀释度均为1∶100。对照试验选用PBS替代一抗，其他进程相同。以气道滑润肌层为剖析目标，进行测定P27、Bcl-2阳性表达的均匀吸光度值。
1.3 计算学办法
使用 SPSS 19.0计算软件对数据进行剖析，计量材料予以正态性查验，用均数±标准差（x±s）标明，组间比较选用t查验，两变量的相关剖析选用Pearson等级相关法，P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 各组大鼠症状、体征比较
在接连OVA激起后，哮喘组大鼠呈现打喷嚏、烦躁不安、呼吸短促、口腔分泌物增多等症状，而且有哮鸣音，部分状况严重的呈现腹肌抽搐、反响迟钝、行动缓慢等体现，但无大鼠逝世，对照组则无此种体现。
2.2 两组大鼠肺安排病理结构的改动
两组大鼠的肺安排白腊切片，进行HE染色后，在光镜下调查到A组大鼠肺安排内支气管上皮开裂、掉落，支气管壁和血管周围可见较多的炎性细胞如嗜酸性粒细胞、淋巴细胞滋润，管腔内可见黏液栓构成，对照组未见上述现象。见封三图2。TUNEL法显现：哮喘组大鼠ASMC中TUNEL阳性细胞显着少于正常对照组，凋亡指数（AI）哮喘组为（3.6±0.2），正常对照组为（6.1±0.3），（t=11.12，P<0.01），见封三图3。
2.3两组大鼠中细胞分类计数的比较
哮喘组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞占细胞总数的百分比均显着高于正常对照组（P<0.01），归纳上述成果提示哮喘造模成功，见表1。
2.4 免疫组化成果
免疫组化调查各组大鼠肺安排P27、Bcl-2表达。Bcl-2蛋白均表达于胞浆，阳性细胞胞浆呈棕黄色，首要定坐落滑润肌细胞、支气管上皮细胞及散在的炎性细胞，哮喘组Bcl-2表达量显着高于正常对照组（P<0.01），见封三图4。P27蛋白首要定位在细胞核，胞质少数表达，哮喘组P27表达量显着低于正常对照组（P<0.05），见封三图5，表2。
2.5相关性剖析
滑润肌细胞中P27表达与细胞凋亡呈正相关（r=0.612，P<0.05）。
3 评论
近年来跟着对支气管哮喘发病机制研讨的不断深入，研讨者发现气道壁的结构改动即气道重塑（airway remodeling）[9-12]是哮喘除气道缓慢炎症以外又一重要病理特征，是哮喘患者呈现不可逆或部分不可逆气流受限及继续的气道高反响性的病理学根底。哮喘时气道滑润肌细胞存在增殖添加和凋亡缺乏[13]，一起参加气道重塑的构成。因而，应该把支气管滑润肌细胞作为哮喘气道重塑研讨的标靶。
近年来，跟着细胞分子生物学的开展，对调控细胞增殖的中心事情即细胞周期的调控机制有了更为深入的知道。各种丝裂原经过不同的信号传导途径促进细胞增殖，都是要经过细胞分裂周期来完结的，而各级细胞因子对细胞周期进行了精细的调控。P27基因定坐落人类染色体12p13，编码198个氨基酸，具有高保存性。P27蛋白首要定坐落细胞核，N段第28-87位氨基酸中有两个丝氨酸磷酸化位点，介导周期蛋白依靠激酶（CDK）活性的按捺。P27作为细胞周期负性调理因子，动物研讨发现，简直一切安排均表达P27蛋白，参加细胞增殖和凋亡调理的P27蛋白极有或许在一些与细胞凋亡严密相关的疾病中扮演着重要人物。对乳腺癌细胞和其他肿瘤细胞的研讨标明P27的過度表达不只诱导细胞周期阻滞，还促进凋亡发作[14-17]。凋亡一般发作在G1期，G1期的阻滞会加快或促进凋亡。所以G1晚期表达的P27蛋白应该是凋亡调理的节点之一。携有P27的腺病毒载体已经在动物试验中具有很好的促细胞凋亡效果。其对气道滑润肌细胞的凋亡是否也有调理效果？P27是经过什么途径促进细胞凋亡的？endprint
細胞凋亡是受严格操控的细胞逝世进程，与多种疾病密切相关，是当今生命科学研讨中最抢手的范畴之一。在细胞凋亡进程中，Bcl-2宗族成员起着至关重要的效果，其间Bcl-2被认为是按捺细胞凋亡最重要的调控基因。Bcl-2 宗族关于线粒体膜上的膜通透性孔道的敞开和关闭起要害的调理效果。有研讨发现，Bcl-2可按捺线粒体膜电位的下降，削减细胞色素C和凋亡诱导因子的开释及Caspase（半胱天冬酶）的激活，然后按捺细胞凋亡[18-19]。在无逝世信号影响时，Bcl-2作为抗凋亡蛋白被细胞器膜阻隔起来，在收到逝世信号影响时便发作构象改动，从胞液易位到线粒体外膜上，使抗凋亡蛋白损失对凋亡的按捺[20-21]。经过本试验成果显现哮喘组P27蛋白的表达量低于对照组，相关剖析成果标明，P27表达量与细胞凋亡率呈正相关，提示P27分子或许参加调理气道滑润肌凋亡进程，哮喘组P27表达削减，Bcl-2表达添加，导致滑润肌细胞凋亡缺乏，促进了哮喘气道重塑。本课题组前期研讨发现，P27能激活线粒体凋亡通路，促进细胞凋亡，本研讨成果显现，其效果机制或许是经过调控Bcl-2完成的。
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（收稿日期：2017-10-25）endprint