雷公藤 雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达剖析
胡添源 苏平 张逸风 关红雨 周家伟 童宇茹 高伟 黄璐琦
[摘要] 该研讨克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完好开放阅读框为1 797 bp，编码579个氨基酸，相对分子质量为69.75 kDa、理论等电点为5.37。生物信息学剖析标明，TwMS具有单萜合酶的特征结构域，归于萜类合酶TPSb亚宗族。实时荧光定量PCR检测显现，经茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后，TwMS的相对表达量显着上调，并在24 h到达最高。此外，该研讨在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达TwMS蛋白，为进一步研讨该基因的功用奠定了根底。
[要害词] 雷公藤； 单萜合酶； 生物信息学剖析； 基因表达剖析； 蛋白表达
Cloning and protein expression analysis of monoterpene synthase gene TwMS in Tripterygium wilfordii
HU Tianyuan1， SU Ping2， ZHANG Yifeng1，2， GUAN Hongyu 1，2， ZHOU Jiawei1 ，
TONG Yuru1，2， GAO Wei1*， HUANG Luqi2
（1.Key Laboratory of Collateral Diseases， School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University，
Beijing 100069， China；
2.State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， Chinese
Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
[Abstract] In this study， we cloned a monoterpene synthases， TwMS from Tripterygium wilfordii suspension cells. TwMS gene contained a 1 797 bp open reading frame （ORF）， encoding a polypeptide of 579 amino acids， which deduced isoelectric point （pI） was 6.10 and the calculated molecular weight was 69.75 kDa. Bioinformation analysis showed that the sequence of TwMS was consistent with the feature of monoterpene synthases. Differential expression analysis revealed that the relative expression level of TwMS increased significantly after being induced by methyl jasmonate （MeJA）. The highest expression level occurred at 24 h. TwMS protein was successfully expressed in Escherichia coli BL21 （DE3）， which laid the foundation for identifying the function of T. wilfordii monoterpene synthases.
[Key words] Tripterygium wilfordii； monoterpene synthases； bioinformatics analysis； mRNA expression analysis； protein expression
中藥雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.来历于卫矛科植物雷公藤的根或根的木质部，具有祛风除湿、通络止痛、活血消肿，杀虫解毒等成效。现代研讨标明，雷公藤的药用活性成分萜类物质具有显着的抗炎、抗肿瘤、调理免疫等药理活性[1]，其首要活性成分包含二萜类成分雷公藤甲素和三萜类成分雷公藤红素等。其间雷公藤甲素可有用按捺肿瘤细胞成长，对胰腺癌的医治效果显着[23]，此外，雷公藤甲素还具有神经养分活性，是医治帕金森和老年痴呆等疾病的重要活性分子[45]。雷公藤红素除了具有神经维护效果和抗遗传性疾病等效果外，近年来还被报道是一种瘦素增敏剂，能够起到瘦身的效果[6]。
单萜化合物是由2个异戊二烯结构单元组成的链状或环状化合物，广泛存在于植物挥发油和树脂中[7]。 单萜化合物多具有较强的香气和生物活性，在植物种群竞赛、招引昆虫传粉、防护植食性动物和操控病虫害发作等方面发挥着重要效果[810]。植物单萜由质体内的4磷酸2甲基赤藓糖 （2CmethylDerythritol4phosphate，MEP）途径组成，其前体物质为牻牛儿基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）。单萜合酶 （monoterpenesynthases，monoTPS）是单萜生物组成的要害酶，单萜合酶基因的表达是植物成长发育进程中所有必要的，具有显着的时空表达规则，其基因宗族的不同成员往往在安排或器官的特定发育阶段表达，以组成植物通讯和生物防护所需的化感物质[1112]。单萜合酶基因的表达对环境的影响极为灵敏，生物钳制等外在压力可激活单萜合酶基因表达生成相应的单萜化合物，以抵挡食草动物、病虫害和病原菌等，许多单萜是植物防护体系的重要组成部分[10，13]，对植物的成长发育具有重要意义。
本研讨初次克隆得到1条雷公藤的单萜合酶基因，并对其进行了生物信息学剖析、茉莉酸甲酯（MeJA）诱导表达剖析，以及IPTG 诱导蛋白表达剖析等研讨，为深入研讨雷公藤单萜合酶基因功用以及对雷公藤植物成长发育的调控机制奠定了根底。
1 资料
1.1 雷公藤悬浮细胞
试验所用资料来历于本试验室继代保存的悬浮细胞。培育办法：在含有 0.5 mg·L-1 2，4D （2，4二氯苯氧乙酸） +0.1 mg·L-1 KT （激动素） + 0.5 mg·L-1 IBA （吲哚丁酸） 的MS 液体培育基中，于25 ℃，120 r·min-1漆黑条件下振动培育。
1.2 菌株
试验中运用的 Escherichia coli trans 5α及E.coli BL21（DE3）购自北京全式金生物技能有限公司。
1.3 试剂及仪器
2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASYT3 Cloning Kit 购自北京全式金生物技能有限公司；RNA 纯化试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA收回试剂盒、质粒小提试剂盒、Fast Quant RT Kit （With gDNase） 购自天根生化科技（北京）有限公司； KAPA SYBR FAST Universal 2×qPCR MasterMix 购自 KAPA Biosystems 公司；Dnase I，Phusion HF PCR Master Mix，BamHⅠ 限制性内切酶，PstⅠ 限制性内切酶及 T4 DNA 衔接酶购自NEB（北京）有限公司； IPTG 为 Sigma 品牌，购自泰科兰博生物科技有限公司；其他化学试剂为国产剖析纯。PCR 扩增仪型号为 ABIverity；实时定量 PCR 仪型号为 ABI 7300 体系；蛋白电泳仪型号为BIORAD Mini PROTEAN Tetra System；蛋白扫描仪型号为 UMAX PowerLOOK 21OOXLUSB；引物组成及测序效劳由北京睿博兴科生物技能有限公司完结。
2 办法
2.1 雷公藤总RNA提取
取培育 10 d的雷公藤悬浮细胞，参加 MeJA诱导子，使之终浓度为 50 μmol·L-1。别离于诱导后 0，4，12，48，72 h 后选材，液氮速冻后置于-80 ℃ 冰箱保存。运用 CTAB 法提取雷公藤悬浮细胞总 RNA，并用 DNase （NEB） 和 RNA 纯化试剂盒去除基因组污染，将纯化的 RNA用液氮速冻后置于-80 ℃ 冰箱保存。
2.2 雷公藤单萜合酶基因克隆与测序
参阅雷公藤悬浮细胞转录组数据结合NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） BLAST，取得雷公藤单萜合酶TwMS基因序列和开放阅读框（open reading frame，ORF），规划cDNA克隆引物（表1）。运用FastQuant RT Kit （With gDNase）将纯化得到的雷公藤悬浮细胞总RNA回转录成cDNA，将各时刻点的cDNA取出少数混合，作为单萜合酶全长基因克隆的模板。依据 Phusion HF PCR Master Mix 阐明书制造PCR体系：cDNA 2 μL，2×Phusion HF PCR Master Mix 25 μL，正反向引物各2.5 μL （10 μmol·L-1），ddH2O 补足到50 μL。反响程序： 98 ℃ 30 s； 98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，重复 35 个循环；72 ℃ 5min。 将 PCR产品切胶收回后衔接 pEASYT3 载体，转化至大肠杆菌 trans5α克隆感受态细胞中，经过菌液PCR挑选阳性克隆进行测序验证。
2.3 TwMS基因序列的生物信息学剖析
将测序得到序列经过InterPro在线软件（http：// www.ebi.ac.uk /Tools/InterProScan）进行结构域剖析，PRABIGERLAND（https：//npsaprabi.ibcp.fr/）进行二级结构猜测，TargetP1.1 server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行信号肽剖析，ExPAS ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）猜测蛋白相对分子质量和理论等电点，TRMHMM server v2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）进行跨膜域剖析，Psort（http：//psort.hgc.jp/）及Wolfpsort（http：//wolfpsort.org/）剖析亚细胞定位，SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/） 进行二级结构剖析和结构域的三维同源建模。依据NCBI BLAST成果下载同源序列，别离运用DNAMAN软件和MEGA 5.0软件进行多重序列比对和体系进化树的构建。
2.4 TwMS基因的表达剖析
以回转录得到的MeJA 诱导不同时刻的cDNA为模板，选取βactin 作为看家基因，检测雷公藤悬浮細胞中单萜合酶TwMS基因表达量的改变，规划实时荧光定量引物（表2）。反响体系如下：2×SYBR green Mix 10 μL，ROX 校对染料 0.4 μL，正反向引各 0.4 μL （10 μmol·L-1），ddH2O补足至20 μL。反响程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个循环后搜集荧光信号，65～95 ℃ 做溶解曲线剖析。反响完毕后剖析扩增曲线和溶解曲线。每个样品做技能重复3次，并经过2-ΔΔCT法[14]剖析TwMS基因的相对表达量。
2.5 TwMS 的蛋白表达剖析
2.5.1 TwMS 表达载体构建 挑选重组蛋白表达载体pMALc2X，对载体和基因序列的限制性酶切位点进行剖析，选取BamH Ⅰ 和 Pst Ⅰ作为载体构建的衔接位点。在雷公藤单萜合酶基因TwMS的ORF两头规划增加限制性酶切位点的引物（表3），运用NEB Phusion HF PCR Master Mix进行PCR扩增，产品经切胶收回后，将收回得到已增加酶切位点的意图片段与载体别离进行双酶切，反响体系：Cutsmart buffer 5 μL，BamH Ⅰ 1 μL，Pst Ⅰ 1 μL，载体或片段5 μL，ddH2O补足至50 μL。反响条件为37 ℃，1 h。反响完毕后将酶切产品进行切胶纯化，收回产品测浓度后依照NEB T4 DNA 衔接酶阐明书制造反响体系，并于16 ℃，衔接过夜。将衔接产品转化至大肠杆菌 trans5α克隆感受态细胞中，涂布在含有100 mg·L-1Amp的LB固体培育基上过夜培育，选取单克隆进行菌液PCR验证，并将阳性成果送公司测序验证。将测序成果正确的菌液扩展培育，保菌、提取质粒，得到的重组质粒即为构建成功的pMALc2XTwMS。
2.5.2 IPTG诱导蛋白表达 将重组质粒pMALc2XTwMS与空载体pMALc2X别离转化到大肠杆菌 BL21（DE3）表达感受态细胞中，挑取阳性单克隆于2 mL LB+100 mg·L-1Amp的液体培育基中，37 ℃ 250 r·min-1培育至A600为 0.6～1.0，取1 mL离心搜集菌体，弃上清，用新的培育基重悬，转移至50 mL 的LB+100 mg·L-1Amp液体培育基中，37 ℃ 250 r·min-1摇到A600约 0.8，参加异丙基硫代半乳糖苷（isopropylbetaDthiogalactopyranoside，IPTG）至终浓度 1 mmol·L-1，20 ℃，200 r·min-1诱导12 h。将诱导完的菌液4 ℃，3 000 r·min-1离心20 min搜集菌体，用新制的TrisHCl 缓冲液（50 mmol·L-1 Tris/HCl （pH 7.5），500 mmol·L-1 KCl，1 mmol·L-1 MnCl2，5 mmol·L-1 dithiothreitol，0.05% NaHSO3，10% glycerol）清洗2次，最后用5 mL TrisHCl 缓冲液重悬菌体。将重悬菌液置于冰中，超声破碎5 min（功率30%，超声5 s，暂停5 s），重复破碎1次后4 ℃，12 000 r·min-1离心 30 min，别离上清与沉积，取上清再离心20 min，再次取上清，即为蛋白粗提物。
以含有空载体pMALc2X的大肠杆菌BL21（DE3）表达的蛋白粗提物为对照，与上述含有重组质粒大肠杆菌BL21（DE3）表达的蛋白粗提物上清一起进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝胶电泳检测。
3 成果与剖析
3.1 雷公藤TwMS全长 cDNA 的取得
规划特异性引物以雷公藤悬浮细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产品经琼脂糖凝胶电泳检测，在1 800 bp邻近有亮堂单一的条带（图1），与预期意图条带巨细共同。测序成果标明，TwMS的ORF巨细为1 797 bp，编码579个氨基酸。
3.2 同源性比对及体系进化剖析
将得到序列在NCBI上进行 BLAST，发现TwMS与其他植物的单萜合酶具有较高的同源性，与毛果杨Populus trichocarpa、葡萄Vitis vinifera、冬青栎Quercus ilex、黑杨Populus nigra、蓖麻Ricinus communis等植物单萜合酶的类似度均大于50%。经过Editseq软件将TwMS序列翻译成氨基酸序列，运用DNAMAN软件进行多重序列比对。比对成果显现， TwMS基因含有多个萜类合酶基因的高度保存结构域，包含富含天冬氨酸的底物结合基序DDxxD，N结尾精氨酸富集基序RRx8W，C结尾NSE/DTE基序以及DDxxD上游35个氨基酸处的高度保存域RxR基序（图2），契合被子植物单萜合酶序列特征[15]。
將TwMS与其他15个不同来历的单萜合酶氨基酸序列进行比对，经过软件 MEGA 5.0相邻衔接法构建体系进化树（图3）。在萜类合酶7个亚宗族（TPSag）中，单萜合酶散布于b，d，f，g 4个亚宗族[1516]。裸子植物单萜合酶归归于TPSd亚宗族，均包含一个RRx8W基序，谱系分解小；被子植物单萜合酶进化较快，分解较大，其间TPSg 亚宗族单萜合酶短少RRx8W基序，催化产品构成非环状、易挥发单萜[17]；大多数被子植物单萜合酶归于TPSb 亚宗族，包含1个RRx8W基序；而TPSf亚宗族是比较陈旧的分枝，首要成员包含仙女扇单萜合酶和拟南芥单萜合酶TPS04。进化树剖析标明，雷公藤单萜合酶TwMS与被子植物黑杨P. nigra亲缘联系最近，归归于被子植物单萜合酶TPSb亚宗族，与TPSf亚宗族亲缘联系较远。
3.3 理化性质与 3 D 结构猜测
TwMS蛋白的相对分子质量为69.75 kDa、理论等电点为5.37，为亲水性蛋白。信号肽剖析显现无信号肽，跨膜域剖析成果标明其为非膜蛋白，无排泄蛋白。亚细胞定位猜测成果显现TwMS或许定位在内质网或质膜上。结构域剖析标明，TwMS在62～270 aa 处含有萜环化酶/异戊烯基转移酶结构域，65～245 aa处编码N结尾结构域，276～540 aa处含有1个金属结合结构域。TwMS蛋白的二级结构猜测成果显现：无规则弯曲和α螺旋结构是其首要结构原件，无规则弯曲占49.41%，α螺旋结构占39.36%，剩下11.22%是长链结构。蛋白三维结构以4Slimonene synthase 2ong.1.A [18]为同源建模模板，建模规模为 56～596位氨基酸残基，序列同源性为44.80%（图4）。
3.4 MeJA 誘导TwMS基因表达剖析
运用MeJA对雷公藤悬浮细胞进行诱导，运用实时荧光定量 PCR 检测以及 2-ΔΔCt 剖析对TwMS基因进行相对定量表达剖析标明，雷公藤单萜合酶基因TwMS对MeJA的诱导十分灵敏，诱导后12 h，MeJA 处理组中基因的表达量上升到0 h的670倍，并于24 h到达最高诱导水平，处理组基因表达水平是同期对照组的1 172.3倍，240 h时TwMS基因的表达康复至正常水平。
3.5 IPTG 诱导 TwMS蛋白表达剖析
TwMS蛋白诱导表达的SDSPAGE 扫描成果标明，在 IPTG 诱导大肠杆菌BL21（DE3）表达后，含有pMALc2X空载质粒的菌株在 42 kDa 处表达了MBP 标签蛋白，含有重组质粒pMALc2XTwMS的菌株在约112 kDa 处有蛋白条带，而空载体菌株在相同的方位无蛋白表达，阐明雷公藤单萜合酶基因PtTPS.terpene synthase. Populus trichocarpa （AII32476）；Vvter1.（-）alphaterpineol synthase. Vitis vinifera （Q6PWU2）；Vvter2.（-）alphaterpineol synthase V. vinifera （NP001268216）；QiMYR. Myrcene synthase. Quercus ilex （Q93X23.1）；PnTPS.monoterpene synthase. P. nigra （AHY21666）；赤色标识表明特征结构域。
4 评论
单萜合酶催化GPP组成品种繁复、功用各异的单萜类化合物，在植物种群竞赛、招引昆虫传粉、生物防护等方面发挥着极其重要的效果。本研讨初次在重要药用植物雷公藤中克隆得到单萜合酶，并经过生物信息学剖析等手法对该基因进行研讨，发现该基因编码蛋白具有典型的单萜合酶结构域，归于萜类合酶TPSb亚宗族，但由于单萜合酶基因宗族
基因品种繁复，经过序列比对、蛋白结构猜测等手法较难估测该单萜合酶的详细催化产品，因而命名为Tripterygium wilfordii monoterpene synthases，简称TwMS。研讨发现，TwMS基因对MeJA的诱导反常灵敏，表达量可上调至1 000倍以上，而MeJA等诱导子诱导基因表达水平的上调可有用进步雷公藤萜类成分的产值[19]，由此估测，TwMS基因很或许参加了雷公藤萜类产品的代谢。单萜合酶基因会因环境影响、生物钳制等原因敏捷表达，由MeJA诱导的灵敏程度来看，TwMS基因很有或许在雷公藤的应激或生物防护进程中发挥效果。此外，本研讨成功在大肠杆菌中对TwMS基因进行了异源表达，为进一步研讨该基因的功用奠定了根底。
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[责任编辑 吕冬梅]