蒲黄松花粉的差异 蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品的DNA条形码判定
马孝熙+孙伟+任伟超+向丽+赵博+张雅琴+宋明+慕泽泾+陈士林
[摘要]现在商场上花粉类药材种类较多，因为在外观形状均呈粉末状，很难区别，加之商场价格较高级要素，故混用和掺伪的状况时有发生，因而花粉类药材的精确判定对大众的用药安全显得尤为重要。该研讨选用DNA条形码技能，对蒲黄、松花粉及其混伪品的基原植物及药材共60份样本进行研讨。经过primer premier 6.0规划出蒲黄ITS2特异性引物PhF-R，其扩增功率高达100%，试验成果标明蒲黄药材的ITS2序列长度为234～249 bp，种内K2P均匀间隔与同属种间K2P均匀间隔非常挨近，但远小于其与混伪品的种间K2P均匀间隔；松花粉药材的ITS2序列长度均为247 bp，ITS2序列种内均匀K2P遗传间隔远小于其与混伪种类间均匀K2P间隔。运用ITS2序列构建的邻接（NJ）树标明蒲黄、松花粉及其混伪品可显着区别，并呈现出杰出的单系性。因而，DNA条形码可对该试验资料精确判定，有助于花粉类药材的监管及商场流转。
[关键词]ITS2；蒲黄；松花粉；DNA条形码
花粉为植物的雄性细胞，因为其间蕴含着丰厚的营养物质，所以具有很高的营养价值和药用价值[1]。蒲黄[2]为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifolia L.、东方香蒲T. orientalis Presl.或同属植物的枯燥花粉，始载于《神农本草经》，其味甘、性平，具有凉血止血、活血化瘀的成效[3-6]。松花粉[7]，即松科植物马尾松Pinus massoniana Lamb.、油松P. tabuliformis Carr.或同属数种植物的枯燥花粉，始载于《新修本草》，味甘平无毒[8]，具有收敛止血、燥湿敛疮的成效。
近年来国内花粉商场反常火爆，其价格比年攀升。有文献报导[9-13]蒲黄、松花粉、海金沙Lygodium japonicum （Thunb.） Sw.及市售的玉米花粉Zea mays L.存在掺伪的状况，因而对几种易混花粉类药材进行有用判定显得至关重要。陈树山[9]、贾荷丽[10]、陈永林[11]、任燕[13]等曾从性状、理化及显微方面临花粉类药材进行辨别，但传统的判定办法在必定程度上因为药材自身、试验仪器、试验规划等方面的差异而影响对药材的精确判定。
依据DNA测序和序列比对的DNA条形码技能是近年来分子生药判定的研讨热门和方向[14]。DNA条形码（DNA barcoding）是运用基因组中一段公认规范的、相对较短的DNA片段来进行物种判定的分子确诊新技能。该技能于2003年由加拿大分类学家Paul Hebert初次提出，并遭到各国学者的广泛重视。Paul提出以一段650 bp的线粒体基因COI作为动物的通用条形码[15-16]。在植物方面，陈士林等对6 000余份药用植物样本进行DNA条形码序列挑选，提出以ITS2为主，psbA-trnH为辅的药用植物条形码判定体系[17-21]。该体系已在羌活[22]、金银花[23]、冬虫夏草[24]、石斛[25]等宝贵药材上得到了验证。因而本研讨选用ITS2序列来判定易混杂花粉类药材，为保证药材质量及临床用药安全供给参阅。
1 资料
本试验所研讨的资料共60份，其间19份为基原植物样本，收集于新疆、河北、河南、安徽、广东、广西、云南、北京等地，一切基原植物经我国医学科学院药用植物研讨所林余霖研讨员判定，凭据标本保存于我国中医科学院中药研讨所，资料来历见表1；其他41份为药材样本，购于北京、河北、安徽、重庆、黑龙江等地的药市或药店，详细信息见表2。
2 办法
2.1 DNA的提取 关于叶片样本，取样品约25 mg，用球磨仪（Sceintz-48，宁波新芝）以50次/s研磨2 min，运用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取总DNA；而粉末状药材，取样品约40 mg，加700 μL DNA裂解液，在56 ℃水浴的条件下过夜，选用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取总DNA。
2.2 蒲黄引物规划 运用MEGA5.0对ITS2通用引物扩增出的序列进行剖析，定位至蒲黄的“保存区域”，并运用primer premier 6.0规划特异性引物PhF-R。其序列如下，Ph-F：5′-CGCGAACCATCGAGTCTTT-3′，Ph-R：5′- GTTTCTTCTCCTCCGCTTATTT-3′。
2.3 PCR扩增和测序 关于非香蒲属样本，选取ITS2通用引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′ 和S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′作为扩增引物。反响条件为94 ℃变性5 min，经过40个循环（94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最终72 ℃延伸10 min。反响体系为2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物2.5 μmol·L-1各1.0 μL，DNA模板量约30～60 ng，其他用ddH2O补至25 μL；而香蒲属样本，选用PhF-R为ITS2扩增引物，退火温度54 ℃，其他条件同上。电泳查看PCR扩增状况，进行双向测序。
2.4 ITS2序列剖析 对取得的测序成果运用Codoncode Aligner V3.7.1校正拼接，删去低质量区，去除引物区。依据隐马尔可夫模型HMMer注释除掉5.8S和28S，然后取得ITS2序列。运用软件MEGA 5.0对一切ITS2序列进行剖析比对[26]。依据K2P模型进行遗传间隔的核算、体系聚类树的构建，关于体系树各分支的置信度选用自举查验法bootstrap查验（1 000次重复）。endprint
3 成果与剖析
3.1 蒲黄PCR扩增功率 本试验中，以蒲黄药材及基原植物共29份样本的总DNA为模板，选用通用引物进行PCR扩增，成果仅有2份样本的DNA扩增成功，且测序正常，扩增功率仅为6.70%。依据已取得的2条蒲黄ITS2序列，对蒲黄从头规划引物。选用针对蒲黄已知序列规划的新引物，对之前提取的总DNA进行从头扩增，成果显现29份样本悉数扩增成功，其间26份样品测序成果合格，扩增功率高达100%。
3.2 商场上购买的药材的判定 对商场上购买的41份药材样本进行试验，得到的ITS2序列进行BLAST比对后发现：22份蒲黄药材中有7份样品（KJ474686～92）与GenBank登陆号KF265389的类似度为100%，比对成果为长苞香蒲；有6份样品（YC0518MT10～15）与GenBank登录号KF265390的最高类似度为84%，比对成果为香蒲属植物，暂不能判定到种；有6份样品（KJ474656～61）与GenBank登陆号FJ949066，DQ996015的类似度为100%，比对成果为水稻；此外，22份蒲黄药材中有3份样品（YC0518MT16～18）在测序过程中存在套峰的状况。8份松花粉药材中有5份样品（KJ474648～52）与GenBank登录号GQ434744的类似度为100%，比对成果为马尾松；其他3份样品与GenBank登录号JF829712，JF829701，GQ434747的类似度均为100%，比对成果为松属植物，暂不能判定到种。依照相同的办法，4份海金沙药材的判定成果均为海金沙。7份玉米花粉资料的判定成果均为玉米。
3.3 松花粉、蒲黄及混伪品的种内、种间变异剖析 马尾松P. massoniana 种内不同来历样品8条ITS2序列长度为247 bp，均匀GC含量为60.73%，种内K2P间隔为0，种内无变异位点，共取得KJ474648型1种单倍型。油松P. tabuliformis 种内不同来历样品3条ITS2序列长度为247 bp，GC含量为60.32%，种内K2P间隔为0，种内无变异位点，共取得KJ474642型1种单倍型。松花粉不决种的3份样品（YC0405MT02～04）的ITS2序列长度为247 bp，共取得YC0405MT02型1种单倍型。对3个物种的序列剖析发现，仅在74 bp处有一变异位点，即马尾松在74 bp处的碱基为C，油松和不决种样品的序列在74 bp处为T。油松与马尾松的种间间隔为0.004，与混伪品的最小种间间隔为0.657；马尾松与混伪品的最小种间间隔在0.670。
长苞香蒲T. domingensis 种内不同来历样品9条ITS2序列长度为234 bp，均匀GC含量为78.63%，种内K2P间隔为0，种内无变异位点，共取得KJ474686型1种单倍型。水烛香蒲T. angustifolia 种内不同来历样品3条ITS2序列长度为234 bp，均匀GC含量为79.92%，有2个位点存在变异，即81位点处A-G变异和141位点处T-C变异，共取得3种单倍型。种内最大K2P间隔为0.022，与混伪品的最小种间间隔为0.337。蒲黄不决种的6份样品（YC0518MT10～15）的ITS2序列长度为249 bp，共取得YC0518MT10型1种单倍型。序列比对信息见表3。
海金沙L. japonicum种内不同来历样品7条ITS2序列长度为267 bp，共取得5种不同的单倍型，其间KJ474663型3条，KJ474662型1条，KJ474665型1条，KJ474666型1条，KJ474668型1条。玉米花粉Zea mays种内不同来历样品10条ITS2序列长度为224 bp，共取得4种不同的单倍型，其间KJ474669型7条，KJ474671型1条，KJ474674型1条，KJ474678型1条。水稻Oryza sativa种内不同来历样品6条ITS2序列长度为232 bp，共取得KJ474656型1种单倍型。依据得到的ITS2序列的单倍型，运用邻接法（NJ）构建体系发育树，见图1。从所构建的体系发育树中可以看出松花粉、蒲黄、海金沙、玉米花粉、水稻各独聚一支，因而，ITS2序列能精确辨别蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品。
4 评论
蒲黄为多年水生草本单子叶植物，国外学者对水生单子叶植物的DNA条形码有比较深化的研讨[27]。在本研讨的过程中，笔者发现当选用通用引物（ITS2F-3R）扩增蒲黄药材时，扩增功率仅为6.70%，这有或许是ITS2F-3R在单子叶植物中的通用性不高导致的。因而笔者以己取得的2条蒲黄序列为研讨目标，运用Primer Premier 6.0软件从头规划了一对引物（PhF-R），其扩增功率可以到达100%。从判定功率视点上看，依据ITS2序列构建的NJ树可以将蒲黄与其混伪品显着分隔，但香蒲属下种级物种间并没有很好的区别，这或许与香蒲属植物的亲缘联系较近有关。而从蒲黄药材的视点来看，《我国药典》2010年版规则蒲黄为同属植物花粉均可，所以关于蒲黄判定到属等级已可完成其与混伪品的精确判定。关于松花粉而言，因为种内均无变异位点，而且经过序列剖析后发现3个物种间仅在74 bp处有一变异位点，不决种的样品序列（YC0405MT02～04）与油松、黄山松（JF829701）、台湾松（JF829712）序列相同，暂不能判定到种，但从松花粉药材的视点来看，其判定到属等级已满意商场的需求。
本研讨在试验中发现蒲黄药材的测序成果中存在套峰的状况，这或许是因为所购的药材为多种植物花粉的混合物或者是多复制基因的存在所导致的[28]。此外，购买的蒲黄药材检测为水稻，且掺伪药材份数占蒲黄药材总数的27.27%，一方面阐明药材的掺伪状况可以经过DNA条形码技能检测出来，一起断定混用或掺伪的详细混伪品；另一方面阐明晰在商场上蒲黄掺伪状况杰出。这有或许影响蒲黄的药效乃至是影响到用药者的健康，因而相关部分应该加大蒲黄药材的监管力度。endprint
本文选用DNA条形码技能，依据ITS2序列，对60份蒲黄、松花粉及其混伪品样品进行研讨，试验中规划的蒲黄ITS2引物PhF-R的扩增功率高达100%，试验成果证明ITS2序列可以精确判定蒲黄、松花粉及其混伪品。此研讨为花粉类中药材的判定供给了新思路，为药材质料的精确收购、商场流转及质量监管供给了新的技能手段。
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Identification of cattail pollen （Puhuang），pine pollen （Songhuafen） and
its adulterants by ITS2 sequence
MA Xiao-xi1，2，SUN Wei2，REN Wei-chao2，XIANG Li2，ZHAO Bo2，ZHANG Ya-qin1，
SONG Ming1，MU Ze-jing3，CHEN Shi-lin2*
（1. School of Chemical Engineering，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China；
2.Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China；
3.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）
[Abstract] DNA barcoding method was conducted for the authentication of pollen materials due to difficulty of discriminating pollen materials bearing morphological similarity. In this study，a specific focus was to identify cattail pollen （Puhuang） and pine pollen （Songhuafen） samples from their adulterants which are frequently mixed-together. Regions of the internal transcribed spacer （ITS2） from 60 samples were sequenced，and new primers for cattail pollen were designed according to the sequence information. The results from the NJ trees showed that the species of pine pollen，Puhuang and their adulterants can be classified as obvious monophyly. Therefore，we propose to adapt DNA barcoding methodology to accurately distinguish cattail pollen，pine pollen and their adulterant materials. It is a great help for drug regulatory agency to supervise the quality of medicinal materials.
[Key words] ITS2；cattail pollen；pine pollen；DNA barcode
doi：10.4268/cjcmm20141208endprint