H_NMR 升麻的1H—NMR指纹图谱—模式识别研讨
沈莉，赵燕燕，谢洪平，刘万卉
[摘要] 意图：树立一种依据1H-NMR指纹图谱-形式辨认的不同种类升麻的辨别办法。办法：以1H-NMR技能测定升麻中三萜皂苷类特征提取物的信息，并转化为数据矩阵，选用化学形式辨认办法中的主成分剖析（PCA）及判别偏最小二乘（DPLS）法进行辨认剖析。成果：1H-NMR指纹图谱-形式辨认可以有用地辨别不同种类的升麻样本。定论：1H-NMR指纹图谱-形式辨认是一种有用的药材分类辨别办法，可以作为药材质量操控的手法之一。
[关键词] 升麻；1H-NMR指纹图谱；形式辨认；主成分剖析；判别偏最小二乘；三萜皂苷
升麻是典型的多基源药材，我国境内有升麻属植物8种，仅作为正品升麻而被2010年版《我国药典》所收载的就有3种，包含升麻Cimicifuga foetida L.（西升麻）、大三叶升麻C. heracleifolia Kom.（关升麻）和兴安升麻C. dahurica （Turcz.） Maxim.（北升麻）[1]。
化学研讨标明，升麻属植物的首要成分为9， 19-环菠萝蜜烷型四环三萜及其苷类，迄今为止，已从各种升麻中别离得到近200种三萜皂苷类化合物[2-3]，以西升麻为质料的三萜总皂苷提取物制剂已成功在国内上市，用于女人围绝经期归纳征的医治[4-5]。在其质料药材质量点评和操控过程中不可避免地要触及升麻种类辨别的问题，因为西升麻中不含或简直不含阿魏酸和异阿魏酸[6-7]，选用2010年版《我国药典》办法显着不能满意其种类辨别的要求。本研讨以升麻中的三萜皂苷类化合物为目标，初次选用1H-NMR指纹图谱结合形式辨认的办法对升麻进行研讨，以1H-NMR为辨认变量，运用多种数据剖析办法树立了不同种类升麻的辨认模型，为升麻的种类辨别和质量点评供给了一种行之有用的操控手法。
1 资料
升麻药材（表1）均采自甘肃陇南区域及四川九寨区域，大三叶升麻和兴安升麻均购自产地。一切药材均经烟台大学药学院生药教研室赵燕燕副教授断定。
Bruker AV400型核磁共振波谱仪，QYJ直切式切片机，SF-300高速破坏机，SK1200H超声清洗机，LP5-2A型低速离心机，HSC-24A型氮吹仪，FDU-1100型冷冻枯燥机。氘代吡啶（CIL公司），甲醇（剖析纯，天津四友生物医学技能有限公司）。
2 办法
2.1 甲醇提取物的制备
药材称重后用切片机进行切片，筛去泥土和须根，用高速破坏机将药材破坏，经充沛研磨后过65目筛，取适量样品置于烘箱中，75 ℃下烘3 h后称取1.0 g枯燥粉末置于50 mL塑料离心管中，参加20 mL 70%甲醇，超声提取30 min后以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液在氮吹仪中挥干甲醇，参加适量蒸馏水，混匀后冷冻枯燥，冻干粉末置于枯燥器中避光保存。
2.2 1H-NMR测定及图谱处理
精确称取升麻甲醇提取物冻干粉末20 mg置于5 mm核磁管中，参加0.5 mL氘代吡啶溶解后进行1H-NMR测验。测验用脉冲序列为noesypr1d，谱宽为8 000 Hz，扫描次数128次，采样时刻为4.09 s，弛豫时刻为10 s，混合时刻为0.6 s，温度为25 ℃，在δ 6.04处限制水峰。
经过核磁共振谱仪自带的XWIN-NMR3.5软件进行傅里叶变换，氘代吡啶在1H-NMR谱中出现3个溶剂峰，将中心的溶剂峰定标为δ 7.57，手动调整相位后保存。将此FID文件导入MestReNova软件，调整基线后，将最低场的溶剂峰（δ 8.77～8.67）峰面积定为1，从δ 6.95到δ 0.00以0.01为距离进行积分，发生695个数据点。
2.3 形式辨认办法
形式辨认是化学计量学研讨中十分重要的内容，经过对杂乱的化学量测数据的剖析而提醒物质的隐含性质。本研讨归纳运用了多种形式辨认办法对1H-NMR指纹图谱所供给的数据进行剖析研讨。一切形式辨认剖析均经过Matlab 7.0软件完结。
2.3.1 主成分剖析（principal component analysis，PCA） 主成分剖析是最为常用的一种数据压缩办法，以最优化办法浓缩及归纳丈量矩阵中的信息，削减数据集维数的一起保存数据会集对方差奉献最大的特征。主成分剖析发生2个矩阵，得分矩阵和载荷矩阵。得分矩阵的行和列别离代表主成分（PCs）和不同的样品，经过得分矩阵的前2或3个主成分作图，可以取得直观的二维或三维聚类图，然后方便地对不同类别进行断定。载荷矩阵的每1列对应1个主成分，其间的每1数值均代表该主成分与原始变量的相关。对每1列作图，即取得该主成分的载荷图，可以在必定程度上反映引起聚类的相关化学成分[8]。
2.3.2 判别偏最小二乘法（discriminant partial least square，DPLS） 判别偏最小二乘法是一种依据偏最小二乘回归（partial least square regression，PLSR）的稳健的判别剖析办法，是一种有监督的形式辨认办法，特别适合于解说变量数多且存在多重共线性，样本观测数少且搅扰噪声大的状况。选用DPLS法对样本的1H-NMR谱进行剖析时，该法可以一起对氢谱矩阵和类别矩阵进行分解，加强类别信息在氢谱分解时的作用，以提取出与样本类别最相关的波谱信息，即最大化提取不同类别波谱之间的差异，因而PLS办法一般可以得到比PCA办法更优的分类和判别成果[9]。
3 成果与评论
3.1 升麻1H-NMR指纹图谱的树立
由典型的西升麻、关升麻和北升麻样品的1H-NMR谱图（图1）可知三者具有高度的相似性，谱峰首要散布在δ 0.0～6.4，以环菠萝蜜烷型三萜皂苷及糖类化合物的信号为主[10]。其间δ 0.85为19位环丙烷亚甲基中一个质子的特征信号，δ 0.8～1.5为三萜母环上角甲基的共振信号，δ 1.0～3.2则为三萜母环上亚甲基和次甲基质子的吸收峰，δ 3.5～5.2还有三萜母环上部分解学位移接近低场的质子以及羟基质子的信号，δ 5.2～5.7则为某些三萜皂苷环上双键的烯氢质子信号。糖类化合物的质子信号则出现在δ 4.0～6.4，其间δ 4.1～5.3为糖环上质子信号，δ 6.2处的双峰为糖端基质子的信号。而在δ 6.4～9.0低场区域，扣除吡啶的溶剂峰，其他多为某些酚酸类或色酮类化合物中部分芳氢质子信号。
谱图一起也展现了3种升麻因化学成分组成差异以及首要相似成分间相对含量不同而发生的某些化学位移及信号强弱的不同。与西升麻比较，关升麻和北升麻的1H-NMR谱图中皂苷类化合物的信号强度显着较低，而糖类、酚酸类及色酮类化合物的信号强度则略高。显着，关升麻和北升麻中三萜皂苷类物质的含量低于西升麻，而糖类、酚酸类及色酮类化合物的含量则相对较高。
3.2 西升麻与关升麻、北升麻的辨别
为便于评论，本研讨将一切样本分为2类，第一类为西升麻样本，第二类为东北升麻样本，包含关升麻和北升麻。
3.2.1 主成分剖析（PCA） PCA办法是一种简略而行之有用的数据压缩办法，本研讨首要选用此法对一切样本的1H-NMR数据进行剖析。成果标明，前3个主成分的累积奉献率到达87.2%，阐明这3个主成分现已可以对85%以上的原变量信息进行解说，故选取这3个主成分进行得分图和载荷图的剖析。
前3个主成分一起表征而成的三维PCA得分图（图2），可以清楚地看到西升麻和东北升麻各自调集成一类，2类样本之间边界明晰，无彼此堆叠。阐明2类升麻之间的确存在差异，而PCA办法可以使用这种差异对其进行差异。从PC1/PC2，PC1/PC3所作的二维得分图（图3），调查这3个主成分关于样本差异的含义。图3显现，西升麻与东北升麻在PC1水平上的差异最为显着：前者悉数调集在PC1得分值较小或为负值的区域，而后者则涣散在PC1得分值相对较大的区域。与之相相似，西升麻的PC3得分值也相对较小，但因为东北升麻在PC3水平上的散布规模较广，故无法与西升麻发生显着的差异。无论是西升麻仍是东北升麻，其PC2得分值均在较大规模内涣散散布，没有显着的调集。由此可见，PC1是西升麻与东北升麻分类的富信息变量，而PC2和PC3对该分类没有显着的差异，只是依靠PC1或PC1/PC2和PC1/PC3均不能取得抱负的分类作用。因而，本研讨选用PC1/PC2/PC3作为西升麻与东北升麻的分类辨认变量，可取得抱负的分类作用。
经过对PC1和PC2的载荷剖析，可以调查引起2类升麻样本之间差异的要素。主成分的载荷图中，负峰意味着对主成分分类图中得分为负的奉献大，反之，正峰则对主成分中得分为正的奉献大。
别离对PC1和PC2做载荷剖析，可取得与1H-NMR谱图相似的载荷图（图4），可以将这些变量与相关的化学位移值一一对应起来，然后更为方便地调查引起PCA分类的相关化学成分。图4显现，δ 0.5～3.0的变量在纵轴上的投影均为负值，该化学位移区间对应升麻中三萜皂苷苷元质子的出峰区域，标明皂苷类化合物的奉献使PC1得分为负值。其间在纵轴上的投影值最大的变量所对应的化学位移为δ 0.75～0.88及δ 1.05～1.40，前者对应19位亚甲基其间一个质子的信号，后者为三萜母核上多个角甲基质子的信号。而δ 4.0～5.2的变量在纵轴上的投影则均为正峰，但强度较弱，标明糖类化合物的奉献使PC1得分为正值，但对PC1影响较小。载荷正值较大的变量首要来自化学位移为δ 4.05～5.15，而载荷负值较大的变量来自化学位移为δ 1.25～1.35，3.6～3.9，5.35～5.55等，依据化学位移区间所对应的化合物类别，可知糖类化合物的奉献使PC2得分为正，而皂苷类化合物的奉献使PC2得分为负。
由此可见，皂苷类成分是引起PCA分类的首要化学成分，即西升麻与东北升麻之间的差异首要体现在所含皂苷类化合物的量上。与东北升麻比较，西升麻大多处于PC1为负的区域，标明其三萜皂苷类成分的含量较高而糖类化合物的含量略低，这与3种升麻的1H-NMR谱图比照成果共同。
关于关升麻和北升麻而言，比较其1H-NMR图谱可以发现，二者之间的相似性远远高于其与西升麻的相似性。PCA分类研讨也证明了这一点：图3显现，无论是在PC1，PC2仍是PC3水平上，2种升麻样本均穿插参差散布，二者之间存在显着的堆叠。显着，关升麻和北升麻之间不存在显着差异。
3.2.2 判别偏最小二乘（DPLS）剖析 判别偏最小二乘（DPLS）法是一种有监督的形式辨认办法，不只可以取得优于PCA办法的分类成果，还可猜测不知道样本的类别。本研讨经过DPLS办法树立不同种类升麻的判别模型，然后完成西升麻与东北升麻的快速检测。
每一类升麻样本都被随机地分为2个调集，即校对集和猜测集。西升麻的校对会集有25个样本，猜测会集有13个样本；东北升麻则分为20个校对集样本和10个猜测集样本。首要将校对集样本作为规范样本，使用偏最小二乘回归办法树立校对模型，然后将未参加建模的剩下样本作为猜测样本，将其1H-NMR数据代入模型中进行剖析。
剖析成果显现，以PC1和PC2所作的得分图（图5）对2类样本具有杰出的差异作用。一切的西升麻样本都团聚在一个较小的区域之内，散布较为会集，比较之下，因为将关升麻和北升麻兼并作为一类样本进行剖析，所以该类样本的离散性相对较大，散布规模也较广。这一成果阐明西升麻样本之间的差异较小，预示其质量较为安稳；而关升麻和北升麻组成的一类样本之间的差异则较大，标明它们之间的质量差异较大。
以图5中所绘虚线为界，西升麻和东北升麻显着地被差异为2类，彼此间可以很好地别离且不存在类间堆叠，标明所树立的辨认模型具有杰出的别离度。一起，每一类的猜测集样本都可以精确地落在校对集的散布规模之内，也不存在显着的过拟合现象，标明该模型可以精确判别升麻类别，对猜测集样本的正确辨认率为100%，而且具有杰出的稳健性，然后保证了该办法关于不知道升麻种类判别的重复性。
4 定论
升麻属植物中遍及含有三萜皂苷、酚酸及色酮类化合物，但是不同种类升麻中这些成分的组成及含量存在较大差异，研讨标明，西升麻中三萜化合物的含量显着高于关升麻和北升麻[11-12]。因而，以三萜皂苷类化合物为首要有用成分，临床用于围绝经期归纳征等内分泌系统疾病医治时，关升麻和北升麻不能替代西升麻。为保证药物临床安全有用，有必要严格操控质料药材的质量，有关升麻种类的有用辨别也就显得尤为重要。升麻中三萜皂苷类化合物的1H-NMR指纹图谱可以供给很多丰厚的信息，以此为基础进行升麻的种类辨别和质量操控无疑更为实在牢靠。
本研讨以1H-NMR为辨认变量，运用PCA和DPLS办法对不同种类的升麻样品进行剖析，均可完成西升麻与东北升麻（包含关升麻和北升麻）的分类。PCA得分及载荷剖析标明，西升麻样本和东北升麻样本之间有显着差异（在PC1水平上），三萜皂苷类化合物是引起这一差异的首要化学成分，此类化合物在西升麻中的含量较高，而在东北升麻中所含糖类等成分的量则较高。经过DPLS办法则可树立稳健的辨认模型，该模型具有杰出的别离度和安稳性，猜测精确率可达100%，可以完成西升麻样本和东北升麻样本之间的快速、精确分类。
以三萜皂苷类化合物为目标的1H-NMR指纹图谱-形式辨认办法是依据药材特征性总成分的剖析办法，其成果可以更为实在地反映药材的内涵质量，完成不同种类升麻的有用、快速辨别，是较现有药典办法更为科学、精确的辨别办法。
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Classification of Cimicifuga species based on 1H-NMR fingerprint
combined with pattern recognition technique
SHEN Li1， ZHAO Yan-yan2， XIE Hong-ping3， LIU Wan-hui2*
（1. School of Medicine and Pharmacy， Ocean University of China， Qingdao 266003， China；
2. School of Pharmacy， Yantai University， Yantai 264005， China；
3. College of Pharmaceutical Sciences， Soochow University， Suzhou 215123， China）
[Abstract] The metabolomic analysis of three Cimicifuga species was performed using 1H-NMR spectroscopy and pattern recognition （PR） techniques. A broad range of metabolites could be detected by 1H-NMR spectroscopy without any chromatographic separation. The analysis using principal component analysis （PCA） and discriminant partial least square （DPLS） of the 1H-NMR spectrum showed a clear discrimination between C. foetida and the other two species. The major metabolites responsible for the discrimination were triterpenoid saponins and saccharides. These results indicated that the combination of 1H-NMR and PR provides a useful tool for chemotaxonomic analysis and authentification of Cimicifuga species， and could used for the quality control of plant materials.
[Key words] Cimicifuga； 1H-NMR fingerprint； pattern recognition； principal component analysis （PCA）； discriminant partial least square （DPLS）； triterpenoid saponin
doi：10.4268/cjcmm20130215
[责任编辑 孔晶晶]