肉苁蓉价格一斤 载淫羊藿素多孔PLGA/TCP联合微骨折术修正兔膝关节软骨残缺的开始调查
李伟+王战伟+伍晓+于斐+张文涛+江长青
[摘要]意图 研讨载淫羊藿素多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）/磷酸三钙（TCP）资料联合微骨折术修正兔膝关节软骨残缺中骨与软骨结合的特性。办法 24只兔子制作膝关节软骨残缺动物模型，随机分红空白组、对照组、试验组，每组8只，在软骨残缺处进行微骨折处理，别离不植入资料、植入PLGA/TCP资料和植入携载淫羊藿素的PLGA/TCP资料，6个月后进行CT点评及大体调查。成果 CT显现试验组膝关节资料构建骨形状结构杰出，对照组骨形状结构稍差，空白组杰出骨支架结构损失；大体调查显现试验组修正生软骨安排色泽挨近正常，对照组软骨色泽稍暗淡，空白组示无软骨修正，大体评分成果显现试验组优于对照组及空白组（P<0.05），对照组优于空白组（P<0.05）。定论 携载淫羊藿素的PLGA/TCP资料修正兔膝关节软骨残缺其支架结构与骨整合杰出，软骨大体调查作用杰出，为进一步探究其修正作用供给开始根据。
[关键词]PLGA/TCP资料；淫羊藿素；软骨残缺；开始调查
[中图分类号] R276.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）08（a）-0007-04
[Abstract]Objective To explore the characteristics of the PLGA/TCP scaffolds incorporating icariin in repairing the defect of knee cartilage of the rabbits.Methods The model of cartilage defect was created on the patellar groove.They were drilled by micro-fracture and divided into blank group，control group and experimental group，which received no scaffold，PLGA/TCP scaffolds and the the PLGA/TCP scaffolds incorporating icariin.They were sacrificed after 6 months.CT was used to explored the bone scaffold/three-dimensional structure and the gross observation was used to evaluated the articular cartilage.Results The CT scan showed they had whole and complete structure of knee in the experimental group and worse structure in the control group，the blank group had lose the whole structure.The gross observation showed the experimental group kept fresh color，and grey in the control group，the defect was kept in the blank group.The experimental group was better than that in control group and blank group（P<0.05），and control group was better than blank group （P<0.05）.Conclusion The PLGA/TCP scaffolds incorporating icariin can keep good structure in repairing the defect of knee cartilage.The gross observation of the articular cartilage in the experimental group is best.It provides primary basis for exporing the repair effect father.
[Key words]PLGA/TCP scaffold；Icariin；Defect of cartilage；Primary observation
伤口、肿瘤、炎症等引起的关节软骨残缺在临床实践中常见，软骨本身修正才能有限，直径>4 mm时一般不能自行修正。尽管可选用异体软骨细胞修正、骨膜修正等多种办法，但大多近期作用抱负，远期作用不确切乃至恶化。其重要原因是不能构成结构杰出的有功用性软骨安排，假如只构成带有基质的软骨安排，而不能与软骨下骨、骨安排构成杰出的结合，便不能接受相应力学影响。许多学者都经过不同的办法构建安排工程骨软骨复合体来修正骨软骨联合损害[1]，成果显现骨软骨复合体不管是功用学评分，仍是GAG含量都要优于单纯的软骨修正[2]。
近几年跟着安排工程技能的快速开展，支架、成长因子和种子细胞都有迅猛前进，本研讨运用中药淫羊藿素（Icariin）作为细胞因子并于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）/磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）资料，使之在植入后能够构成新的软骨安排，然后到达软骨与软骨下骨、骨安排杰出的结合。本研讨还经过功用训练，使软骨构建杰出力学功用，进行全体的修正与重建，开始调查相应资料对骨与软骨整合的作用，为进一步医治软骨残缺供给根据。
1资料与办法
1.1试验动物与资料
挑选雄性新西兰兔，6个月龄，体重2.0～2.5 kg，由西安市迪乐普生物资源开发有限公司供给[出产许可证：SYXK（粤）2010-0106]，遗传布景清晰。养殖条件：坚持室温（23±2）℃，相对湿度60%～65%，分笼养殖，喂规范颗粒饲料，自在饮水。PLGA/TCP资料由深圳-香港肌肉骨骼关节健康科学立异中心协作渠道具有具有自主知识产权的、自行规划与制作的生物资料快速成形机（如Tiss Form、Med Form和生物资料快速成形试验渠道）在-10～-20℃低温下PLGA能够复合Icariin分子，其间Icariin的含量为1×10-5 mol/L[3]，然后在冻干机中抽干，制备有必定的机械强度、利于血管向内成长的、促进成骨细胞成长的骨修正资料，相对于现在缺少成形规划的常用的磷酸钙基资料，这一技能愈加契合安排工程安排再生的需求，此资料在紫外线下进行消毒。
1.2动物模型制备分组及软骨修正
运用戊巴比妥钠对24只新西兰兔进行静脉麻醉，惯例消毒之后，于无菌条件下任选动物左边膝关节做切断，露出股骨表里髁关节面后，用手摇钻在左膝关节股骨髁间非负重区中心钻孔，直径5 mm，深约1 mm，达软骨全层，按体重随机分为空白组、对照组及试验组，每组8只。造模后各组进行微骨折医治，运用4.5 mm的克氏针构建关节软骨残缺模型，深度约4 mm，深达软骨下骨。空白组不植入资料让其自行修正；对照组于动物软骨残缺处植入空白的PLGA/TCP资料，惯例缝合切断；试验组于动物软骨残缺处植入携载Icariin的PLGA/TCP资料，并进行妥善嵌压固定，用庆大霉素2×104 U冲刷关节腔后封闭切断，术后抗生素运用3 d，让其自在活动。
1.3动物处死、选材及大体调查
正常饲喂6个月后选用过量麻醉的办法处死动物，处身后翻开双侧膝关节囊，取膝关节股骨髁及部分滑车部位的软骨进行大体调查，调查膝关节有无关节积液和滑膜肿胀等滑膜炎体现，于解剖显微镜下调查股骨内髁关节面的病理改动，并进行大体标本评分。按以下准则评分。0分：关节面光整，色泽如常；1分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽暗淡；2分：关节面溃烂，软骨残缺深达软骨表中层；3分：关节面溃疡构成，残缺深达软骨深层；4分：软骨剥脱，软骨下骨质露出[4]。
将处死新西兰兔的膝关节软骨标本在CT下进行扫描，CT值挑选为SPOV 32.0 cm，120 KV，100 mA，TI0.5，调查其内部结构。
1.4计算学处理
选用计算软件SPSS 19.0对试验数据进行剖析，计量资料以均数±规范差（x±s）表明，选用t查验，等级资料选用秩和查验。以P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1 CT点评
含淫羊藿素的PLGA/TCP资料能构成网格状或圆柱状三维结构，均匀，裁成直径4.5 mm，长4 mm巨细，在这个三维结构里，构建一个边长为0.5 mm巨细的孔隙，构成一个立体样的结构。空白组软骨显着残缺，内部的支架结构损失，与软骨残缺面相通（图1A）；对照组PLGA资料软骨外表现已修正尚可，资料现已降解，但其内部的结构却显得疏松，难以起到杰出的支架结构（图1B）；试验组显现此资料与兔膝关节整合杰出，6个月后软骨外表现已彻底交融，CT图显现其内部结构清楚，可见资料现已降解，有显着的格网状支架结构，并与软骨外表相通（图1C）。
2.2大体调查及评分
本试验显现手术傍边能很好地构成一个边际润滑的圆形微骨折（图2A），一起又能很好地将资料植入软骨残缺处（图2B），外表可见从小孔里渗出骨髓间质干细胞，可很好地掩盖在资料的外表（图2C）。空白组大体标本软骨修正关节面稍粗糙，色泽稍暗淡为主（图2D）；对照组大体标本软骨修正关节面稍粗糙，色泽稍暗淡为主（图2E）；试验组大体标本软骨修正关节面润滑，色泽正常，光泽度好（图2F）。大体评分成果显现试验组优于对照组及空白组（P<0.05），对照组优于空白组（P<0.05）（表1）。
3评论
近年来跟着安排工程学技能的开展，关节软骨残缺的修正取得了必定的发展，但迄今为止，不管是工程软骨的种子细胞、支架资料、培育环境等，均还没有任何一种资料被以为最抱负，寻求一种功用性契合安排需求的安排工程化关节软骨是未来研讨的要点[5]。
在软骨安排工程常用的支架资料挑选中，按其来历可分为人工组成和天然资料两大类，其间PLGA是乳酸和乙醇酸聚合而成，其结构和亲、疏水性能够经过两者的不同份额进行调理，进而决议支架资料在体内的机械性能和降解速率[6]，其间PLGA降解过程中发生的酸性产品或许对细胞有毒性作用，在资猜中引进碱性的TCP，可部分中和PLGA降解产品的酸性，改进资料周围环境pH值[7]，有助于消除无菌性炎症，然后有利于细胞的成长。一起，本试验显现PLGA/TCP比单纯的PLGA稍硬，更适合资料的塑性、放置与固定[8]。在本试验成果显现，PLGA/TCP资料或携载Icariin的PLGA/TCP资料都能很好地构建一个支架结构并满意膝关节软骨的修正（图2E，F）及软骨下骨的构建（图1B，C）。
在成长调理因子方面，软骨安排工程的成长因子首要包含转化成长因子、骨构成蛋白、成纤维细胞成长因子、胰岛素样成长因子等，这些成长因子是大分子蛋白质，作用时刻较短，简单变性，提取较困难，费用较高。研讨显现，天然植物活性分子淫羊藿素是一种小分子中药，广泛被应用于骨科临床，它不仅能促进成骨细胞的分解，还能增强其增殖才能，而且淫羊藿苷组分解与增殖才能优于rhBMP-2组，其机制或许是淫羊藿苷能够上调OPG基因表达，下调RANKL基因表达，然后削减骨吸收，促进骨构成[9-10]，一起它还能明显添加成骨细胞碱性磷酸酶的活性，进步骨修正才能[11]。淫羊藿素还有一个重要的功用，促进骨髓间质干细胞向软骨细胞定向分解，但不导致软骨细胞的肥壮[12]。它还能进步软骨细胞体外细胞外基质的组成及相关基因的表达，是软骨安排工程中杰出的成长因子[3]。试验显现其能使自体软骨细胞的蛋白多糖相关基因、Ⅱ型胶原纤维相关基因、SOX9等的表达从99.7%上调到248%，1～4周时使蛋白多糖、Ⅱ型胶原的组成添加4～5倍，并加快构成的软骨安排中的细胞水凝胶结构，它乃至能够进步成年兔模型骨软骨残缺的修正功率，进步新构成的软骨与软骨下骨的整合[13]。本试验显现，载淫羊藿素的PLGA/TCP资料相对PLGA/TCP资料不管在软骨修正大体调查及CT点评上都有杰出的作用。
微骨折技能修正关节软骨残缺是骨科临床和试验研讨的热门之一[14]，它是指在软骨全层剥脱的软骨下骨暴露部位打磨或钻孔，使软骨下血管决裂，人为造满足层损害，然后在暴露的骨外表构成一层纤维凝块，为骨髓间充质干细胞的移行供给支架，在无过渡负荷的情况下，未分代的本质细胞游移至凝块内，并增殖分解成软骨细胞。与根除暴露的骨面比较，小直径、多点钻孔可生成更为安稳的修正安排。微骨折技能可为软骨支架发明一个能够与骨髓相连的空间，然后为此支架从骨、软骨下骨到软骨层进行全体性构建供给活性细胞及成长因子。一起，现在的观念以为微骨折术结组成长因子或资料更能进步其修正软骨的才能[15]。本试验的CT扫描显现其修正后能彻底修正微骨折构成的骨残缺，一起，PLGA资料能构成一个杰出的通道，使骨髓内细胞或许经过资料的微孔隙进行软骨残缺外表。
中药是我国一个瑰宝，里边有许多有用的药物，尤其在骨科的中药医治中有许多有用的办法。本研讨选用现已老练加工的高纯度的传统中药淫羊藿素，它远比大分子蛋白质的成长因子要廉价的多，因为它是小分子，在制备资猜中不易变性，更简单与PLGA/TCP资料进行结合而且逐步释放对软骨残缺进行修正，是一种杰出的、可缓释的细胞因子，为更有用地挑选杰出的修正关节软骨残缺的资料供给开始调查。
[参考文献]
[1]Nastaran M，Pauline M.Tissue engineering of human cartilage and osteochondral composites using recirculation bioreactors[J].Biomaterials，2005，26（34）：7012-7024.
[2]Cui W，Wang Q，Chen G，et al.Repair of articular cartilage defects with tissue-engineered osteochondral composites in pigs[J].J Biosci Bioeng，2011，111（4）：493-500.
[3]Zhang L，Zhang X，Li KF，et al.Icariin promotes extracellular matrix synthesis and gene expression of chondrocytes in vitro[J].Phytother Res，2012，26（9）：1385-1392.
[4]Pelletier JP，Jovanovic D，Fernandes JC，et al.Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase[J].Arthritis Rheum，1998，41（7）：1275-1286.
[5]Kock L，van Donkelaar CC，Ito K.Tissue engineering of functional articular cartilage：the current status[J].Cell Tissue Res，2012，347（3）：613-627.
[6]Bini TB，Gao S，Wang S，et al.Development of fibrous biodegradable polymer conduits for guided nerve regeneration[J].J Mater Sci Mater Med，2005，16（4）：367-375.
[7]贾帅军，孟国林，刘建，等.胶原润饰快速成形 PLGA/TCP 人工骨支架体外生物相容性研讨[J].科学技能与工程，2009，9（12）：3207-3211.
[8]Chen SH，Lei M，Zhang G，et al.PLGA/TCP composite scaffold incorporating bioactive phytomolecule icaritin for enhancement of bone defect repair in rabbits[J].Acta Biomaterialia，2013，9（5）：6711-6722.
[9]Yao D，Xie XH，Wang XL，et al.Icaritin，an exogenous phytomolecule，enhances osteogenesis but not angiogenesis——an in vitro efficacy study[J].PLoS One，2012，7（8）： 412-416.
[10]Chao WC，Qi PD，Tian YF，et al.Icariin prevents cartilage and bone degradation in experimental models of arthritis[J].Mediators Inflamm，2016：9529630.PMID：27199510.
[11]Wang XL，Xie XH，Zhang G，et al.Exogenous phytoestrogenic molecule icaritin incorporated into a porous scaffold for enhancing bone defect repair[J].J Orthop Res，2013，31（1）：164-172.
[12]Wang ZC，Sun HJ，Li KH，et al.Icariin promotes directed chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells but not hypertrophy in vitro[J].Exp Ther Med，2014，8（5）：1528-1534.
[13]Li D，Yuan T，Zhang X，et al.Icariin：a potential promoting compound for cartilage tissue engineering[J].Osteoarthritis Cartilage，2012，20（12）：1647-1656.
[14]Takao M，Uchio Y，Kakimaru H，et al.Arthroscopic drilling with debridement of remaining cartilage for osteochondral les ions of the talar dome in uns table ankles[J].Am J Sports Med，2004，32（2）：332-336.
[15]Gomoll AH.Microfracture and augments[J].J Knee Surg，2012，25（1）：9-15.