英诺特流感病毒试剂 优化RT—PCR检测试剂在流感病毒检测中的使用点评
高蕾 燕勇 吉季梅 王恒辉 葛志坚
[摘要] 意图 评论优化的逆转录聚合酶链反响（RT-PCR）检测试剂在流感病毒检测中的运用。 办法 选取乙型流感病毒Yamagata系细胞毒株1株对其倍比稀释，取高、中、低三个稀释浓度提取流感病毒核酸作为模板，选用具有高扩增功率的SpeedStar HS DNA聚合酶和HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase逆转录酶进行PCR反响系统优化，并用优化试剂对三个浓度的流感病毒模板进行批间和批内重复性试验，与惯例试剂TaKara One Step PrimeScript RT-PCR Kit反响试剂盒进行比照研讨。 成果 优化试剂的PCR反响系统整个扩增反响时刻从96 min缩短至55 min；经过Ct值比较，中、低浓度条件下的扩增功率与惯例TAKARA试剂比较差异有统计学含义（P<0.05）；组间比较，差异有统计学含义（P<0.05）；该试剂的组内试验和组间试验的变异系数均小于2%，显现其具有杰出的可重复性。优化试剂比TAKARA公司One Step PrimeScript RT-PCR Kit制品试剂盒节省1/4的本钱，有必定的经济效益。 定论 优化的RT-PCR反响试剂，缩短了PCR反响时刻，具有杰出的安稳性和重复性，一起节省了试剂检测本钱，有必定的经济效益和社会推行价值。
[关键词] 乙型流感病毒；逆转录聚合酶链反响；核酸；优化
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）21-0099-04
Application evaluation on optimized RT-PCR detection reagent in influenza virus detection
GAO Lei YAN Yong JI Jimei WANG Henghui GE Zhijian
Department of Clinical Laboratory， Jiaxing Center for Disease Control and Prevention in Zhejiang Province， Jiaxing 314050， China
[Abstract] Objective To discuss the application of optimized RT-PCR detection reagent in influenza virus detection. Methods One strain of influenza B virus Yamagata was selected and multiply diluted. Three concentrations （high， middle， and low） were selected and viral nucleic acid was extracted as templates. The PCR system was optimized by SpeedStar HS DNA polymeras and HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase with high amplification efficiency. Intra-batch and inter-batch repetitive tests were conducted on the three templates by optimized reagent. The results were compared with those of routine reagent TaKara One Step PrimeScript RT-PCR Kit. Results With optimized reagent， the reaction time of PCR was shortened from 96 min to 55 min. There were significant differences in Ct values between the amplification efficiency of middle and low concentration and that of routine TAKARA kit （P<0.05）. There were significant differences in Ct values among groups（P<0.05）. The variable coefficients were lower than 2% in both intra-batch and inter-batch tests， showing good repeatability. The cost of optimized reagent was about 1/4 lower than that of One Step PrimeScript RT-PCR Kit， showing a certain economic benefit. Conclusion Optimized RT-PCR detection reagent can shorten the response time of PCR， with good stability and repeatability， and can lower the cost， showing a certain economic benefit and promotional value.
[Key words] Influenza B virus； RT-PCR； Nucleic acid； Optimization
流行性感冒（Influenza）簡称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道流行症。经空气飞沫传达、传染性强、传达敏捷，因其病毒抗原易变异，且人类对变异毒株遍及易感，操控难度大，是我国要点监测和防治的流行症之一[1]。传统的试验室确诊办法是经过细胞培育或鸡胚培育别离定型流感病毒，不只耗时长，并且技能要求高，无法及时对迸发疫情做出确诊[2]。如安在前期快速确诊分型、并对病毒变异进行长时刻监测，对流感的防控和临床医治有重大含义[3-6]。跟着检测技能的开展，呼吸道疾病的确诊办法也不断更新，如实时荧光定量PCR[7，8]、恒温扩增[9，10]以及基因芯片技能[11，12]等。本文运用了具有超强耐热性和延伸功率的新一代逆转录酶HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase和具有高扩增功率的SpeedStar HS DNA聚合酶，进一步优化实时荧光RT-PCR反响系统，研讨其反响时刻、敏感性及安稳性，为流感的快速检测供给安稳高效的办法。
1 材料与办法
1.1样本来历
MDCK细胞株B/浙江南湖/1310/2014（乙型Yamagata系）培育液，为本试验室留存，起血凝滴度为1∶128。毒株培育液经磷酸盐缓冲液（PBS）10倍倍比稀释，取得不同浓度的流感病毒培育液。选取其间10倍、104倍、107倍稀释后的培育液别离作为高浓度、中浓度、低浓度样本，分装后于-80 ℃冻存。
1.2核酸提取
将上述高、中、低三个不同浓度的流感病毒上清液，按核酸提取试剂盒（ambion MagMAX-96 Viral RNA）阐明书，在KingFisher Flex system核酸提取仪（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）上提取流感病毒RNA。提取的核酸经检测后-80℃保存。
1.3办法
1.3.1 荧光PCR扩增 本次试验扩增所需的引物、探针均由浙江省疾病防备操控中心病毒所供给。（1）惯例RT-PCR反响液装备和PCR扩增条件参照TaKara 公司 One Step PrimeScript RT-PCR Kit 试剂盒，扩增程序42℃ 30 min；95℃ 15 s；95℃ 10 s；55℃ 15 s，40个循环。（2）优化试剂：选用SpeedStar HS DNA聚合酶和HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase逆转录酶优化反响系统装备，扩增程序如下：50℃ 15 min、95℃ 10 s、95℃ 5 s、55℃ 10 s，40个循环。
1.3.2扩增功率 将上述的高、中、低浓度流感病毒毒株培育液提取的病毒核酸模板，选用优化试剂和传统TAKARA试剂别离进行PCR扩增，比较两种试剂的扩增功率。
1.3.3重复性试验 将上述高、中、低浓度流感病毒毒株培育液提取的病毒核酸模板，按优化试剂的反响条件进行组内试验和组间试验，每个稀释度的Ct值和规范差（SD）及变异系数（coefficient of variation，CV）。根据其定量成果对数值，核算不同办法的变异系数。
1.4 统计学办法
运用SPSS 22.0软件进行统计剖析，计量材料以（x±s）标明，选用t查验，组间比较选用方差剖析，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 PCR反响时刻比较
选用传统TAKARA试剂的整个PCR扩增反响时刻为96 min，选用优化试剂整个PCR扩增反响时刻是55 min，时刻上缩短挨近一半。
2.2 扩增功率比较
高、中、低三种不同浓度，别离用两种试剂进行PCR扩增的Ct值见表1。Ct值反映了模板初始浓度，是荧光信号抵达要设定的阈值时所阅历的循环数，一起也能反响扩增功率[13-15]。选用t查验，在高浓度条件下，两种试剂的检测成果Ct值比较，差异无统计学含义（P>0.05）；在中浓度和低浓度条件下，两种试剂的检测成果Ct值比较，差异有统计学含义（P<0.05），即优化试剂扩增功率略优于惯例试剂。两种试剂检测成果Ct值组间比较，差异有统计学含义（P<0.05），即选用优化试剂检测办法优于惯例试剂。
2.3重复性试验
高、中、低浓度流感病毒毒株培育液提取的病毒核酸模板，用优化试剂进行组内试验和组间试验，每个稀释度的Ct值和规范差（SD）以及变异系数（CV）见表3。3个稀释浓度的Ct值变异系数均小于2%，标明所树立的流感优化试剂的检测系统安稳，具有杰出的重复性。
2.4经济效益
传统TAKARA 公司的“One Step PrimeScript RT-PCR Kit”制品试剂盒的市场价格为2420元/100个反响。本试验装备的优化试剂本钱大约为1820元/100个反响，节省约1/4试验费用，有必定经济效益。
3评论
流感具有迸发俄然、分散敏捷的特色，因为短期内无法取得毒株抗体，因此不能完成血清学检测。荧光定量RT-PCR检测技能具有快速、活络、特异性强等优势，在流感病毒的检测范畴得到了广泛的运用，两层、三重甚至多重PCR技能的运用与开发，无论是准确度仍是检测功率，均得到了很大程度的进步[16-18]。
传统的检出限定量检测的办法是运用意图基因质粒规范品构建，即方针病毒PCR扩增产品经1%琼脂糖凝胶电泳后，方针基因片段纯化收回，衔接于质粒载体，经过纯化、增菌后提取重组质粒，再经过PCR和测序，判定重组质粒中的方针片段正确，如此测得的检出限，依照公式复制数=（质量/分子量）×6.02×1023，直接定量到复制数[19-21]，该办法长处是比较检出限定量的复制数值，比较准确，由质粒DNA作为规范品构建的规范曲线的安稳性和重复性更好。缺陷是整个进程操作比较繁琐，消耗时刻长。
本文以试验室的B型流感病毒细胞培育物直接PBS10倍稀释后的选取代表性的高、中、低浓度，用t查验比较两种办法检测高、中、低三个浓度下的Ct值有无统计学差异。成果标明在高浓度下，两个试剂扩增功率无统计学差异，而中、低浓度条件下，优化试剂扩增功率略优于惯例TAKARA试剂。两种试剂检测成果Ct值组间比较也阐明优化试剂优于常規试剂。长处是操作相对简洁，选材也便利，也具有必定代表性。缺乏是Ct值是个相对数值，不如直接的复制数准确。
本试验首要针对PCR反响系统试剂的优化，选用了高效逆转录酶HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase，该酶可在55℃长时刻反响并坚持杰出的安稳性，高温下坚持高活性的逆转录酶使整个逆转录时刻仅需15 min。一起搭配了用于快速PCR扩增的Hot Star型DNA聚合酶，一般PCR酶的延伸为1 min/kb，而运用SpeedSTAR HS DNA Polymerase延伸可设定为10 sec/kb，完成短时刻内的快速PCR扩增。因此整个扩增进程比传统TAKARA的OneStep RT-PCR扩增程序节省了近一半的时刻，大大进步了检测的工作功率和缩短了临床陈述时刻。
本试验优化试剂高、中、低3个稀释浓度的批内试验和批间试验的Ct值变异系数CV均小于2%，标明优化试剂具有杰出的重复性和安稳性，这对临床治疗和流感疫情迸发的处理特别重要。一起，优化试剂比TaKara公司One Step PrimeScript RT-PCR Kit制品产品试剂盒节省1/4的本钱试验检测费。关于参加国家流感网络试验室，需求进行长时刻哨点医院每周20份流感咽拭子疫情监测的试验室，也有必定经济效益，故有必定的社会推行价值。
本试验的初衷是想树立快速检测病原微生物的反响模型，进步日常工作功率，缩短反响时刻，特别是在流行症迸发的应急检测时。关于树立的系统，是否适应于其他流行症病原体，如手足口、诺如、麻疹、风疹病毒核酸的检测，还需求进一步经过试验室更多的样本进行研讨和验证。
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（收稿日期：2017-04-19）