利伐沙班 高效液相色谱法测定利伐沙班中的有关物质

黄艳+陈雪云+杨雪峰

[摘要]意图 树立利伐沙班的有关物质测定办法。办法 选用高效液相色谱法，色谱柱为Diamonsil C8（250 mm×4.6 mm，5 μm），以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%的25%四甲基氢氧化铵溶液，用冰醋酸调pH至4.8）-乙腈（80∶20）为活动相A，以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%的25%四甲基氢氧化铵溶液，用冰醋酸调pH至4.8）-乙腈（10∶90）为活动相B，梯度洗脫，检测波长为250 nm。成果 利伐沙班与相邻杂质峰以及各杂质峰之间的别离度均>2.0，检测限为0.2～0.5 ng，定量限为1.0～2.0 ng。定论 该办法适用于利伐沙班有关物质的测定。

[关键词]高效液相色谱法；利伐沙班；有关物质；测定

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）08（c）-0078-04

[Abstract]Objective To establish a method to determine the related substance in Rivaroxaban.Methods HPLC method was used，column was Diamonsil C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase A was treated with 5 mmol/L ammonium acetate solution （containing 0.3% 25% tetramethyl ammonium hydroxide solution，adjusted to pH 4.8 with glacial acetic acid）-acetonitrile （80∶20），the mobile phase B was treated with 5 mmol/L ammonium acetate solution （containing 0.3% 25% tetramethyl ammonium hydroxide solution，pH was adjusted to 4.8 with glacial acetic acid）-acetonitrile （10：90），which was used as gradient elution The detection wavelength was 250 nm.Results The resolution of rivaroxaban and its related substance was above 2.0，detection limit was 0.2-0.5 ng，quantification limit was 1.0-2.0 ng.Conclusion The method is suitable for the determination of related substance in Rivaroxaban.

[Key words]HPLC；Rivaroxaban；Related substance；Determination

利伐沙班（Rivaroxaban）是一种Xa因子按捺剂，对Xa因子具有高度的挑选性[1-5]，于2008年在加拿大首要上市，用于髋或膝关节置换术后静脉血栓栓塞症的防备，有极好的体内活性和生物利费用，是能够口服的新式抗凝药，具有杰出的使用远景[6-13]。依据利伐沙班的组成工艺，或许存在的有关物质有乙酰草酰胺（杂质A）、二-草酰胺-尿素（杂质B）、脱氯化合物（杂质C）、氧代邻苯二甲酰亚胺（杂质D）、4，5-二氯化合物（杂质E）、二胺（杂质F）和三胺（杂质G）等。为了确保药品的安全性，现对克己的利伐沙班原料药有关物质测定办法进行研讨，树立了高效液相色谱法（HPLC）不加校对因子的主成分本身对照法测定利伐沙班的有关物质。该办法精确、简洁，能有用操控利伐沙班的质量。

1仪器与试药

岛津LC-2010AHT液相色谱仪，乙腈为色谱纯，水为双蒸水，乙酸铵、25%四甲基氢氧化铵、冰醋酸均为剖析纯，利伐沙班（克己，批号为20140801、20140901、20140902），利伐沙班对照品（MedChem Express，批号为03201），杂质A、B、C、D、F对照品均购自Cato Research Chemicals Inc，杂质E、G对照品均购自Quality Control Chemicals Inc。

2办法与成果

2.1溶液的制造

精细称取利伐沙班适量，加溶剂[活动相A-活动相B（4∶1）]超声溶解并稀释制成每1毫升中约含0.4 mg的溶液，作为供试品溶液；精细量取供试品溶液1 ml，置50 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再精细量取1 ml，置20 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.2色谱条件与体系适用性实验

选用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%的25%四甲基氢氧化铵溶液，用冰醋酸调pH至4.8）-乙腈（80∶20）为活动相A，以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3%的25%四甲基氢氧化铵溶液，用冰醋酸调pH至4.8）-乙腈（10∶90）为活动相B，梯度洗脱（0～20 min，90% A；20～40 min，90% A→50% A；40～60 min，50% A；40～61 min，50% A→90% A；41～75 min，90% A）；检测波长为250 nm；柱温30℃；流速1.0 ml/min。别离精细称取利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，别离加溶剂溶解并制成各对照品溶液及混合溶液；精细量取上述溶液各20 μl，别离注入液相色谱仪，记载色谱图，混合溶液成果见图1。理论塔板数按利伐沙班主峰核算为68 877，利伐沙班与相邻杂质峰以及各杂质峰之间的别离度均>2.0。endprint

2.3进样精细度

取“2.2”项下的混合溶液20 μl注入液相色谱仪，接连进样6次测定，成果各色谱峰面积的RSD均<2.0%（利伐沙班RSD=1.16%、杂质A RSD=0.52%、杂质B RSD=0.44%、杂质C RSD=0.36%、杂质D RSD=1.15%、杂质E RSD=0.67%、杂质F RSD=0.62%、杂质G RSD=0.39%），提示该办法的进样精细度杰出。

2.4专特点实验

精细称取利伐沙班约20 mg，共6份，别离置50 ml量瓶中，按以下条件实验：一份加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份加0.3%的过氧化氢溶液2 ml，摇匀，室温放置2 h，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份加1 mol/L盐酸溶液2 ml，摇匀，室温放置2 h，用1mol/L氢氧化钠溶液2 ml中和，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份加1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml，摇匀，室温放置2 h，用1 mol/L盐酸溶液2 ml中和，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份加溶剂适量，置沸水浴中加热2 h，取出，放冷至室温，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀；一份于（4500±500）lx照耀5 d，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀。别离精细量取上述6种溶液各20 μl注入液相色谱仪，记载色谱图，成果见图2。

2.5检测限和定量限

别离精细称取利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，别离加溶剂溶解并稀释制成每1毫升中约含利伐沙班5 μg的溶液，别离逐级稀释，取20 μl注入液相色谱仪，经剖析，利伐沙班的检测限为0.5 ng（S/N≈3）、定量限为2.0 ng（S/N≈10），杂质A的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质B的检测限为0.2 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质C的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质D的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），杂质E的检测限为0.2 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质F的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10），杂质G的检测限为0.3 ng（S/N≈3）、定量限为1.0 ng（S/N≈10）。

2.6线性关系实验及校对因子的测定

别离精细称取利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，别离加溶剂溶解并稀释成每1 毫升中约含各组分1 μg的溶液，别离精细量取该溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0置10 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，别离取20 μl注入液相色谱仪，记载色谱图，以浓度（μg/ml）对峰面积作规范曲线，线性回归方程、校对因子等成果见表1。校对因子的测定显现，各杂质的校对因子均没有超出0.9～1.1的规模，可直接选用不加校对因子的主成分本身对照法进行定量查看。

2.7溶液稳定性实验

取批号为20140901的供试品溶液，别离放置0、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h后测定，成果主峰峰面积的RSD=0.76%，各杂质峰峰面积的RSD均<2.0%（杂质A RSD=1.06%、杂质B RSD=0.71%、杂质C RSD=0.64%、杂质D RSD=1.84%、杂质E RSD=1.62%、杂质F RSD=0.92%、杂质G RSD=1.23%、总杂质RSD=0.59%），提示供试品溶液24 h内稳定性杰出。

2.8供试品有关物质查看

取3批供试品，依照“2.1”项下的办法制备溶液，依照“2.2”项下的色谱条件，选用不加校对因子的主成分本身对照法测定有关物质，成果见表2。

3评论

3.1检测波长的挑选

别离精细称取利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，别离加溶剂溶解并稀释制成每1毫升中约含各对照品10 μg的溶液，依照分光光度法[14-15]于190～400 nm波长规模内扫描，利伐沙班及杂质A、B、C、D、E、F、G均在250 nm波利益有最大吸收，参照利伐沙班片进口注册规范，将有关物质检测波长确定为250 nm[16]。

3.2色谱条件优化

实验过程中发现，将乙酸铵溶液与乙腈线下预先混合能改进基线漂移；别的，在活动相中参加四甲基氢氧化铵能有用地改进拖尾，进步别离度。

3.3专特点实验

利伐沙班在高温、强光及氧化条件下杂质均无明显变化，且未发生新的降解杂质；在强碱损坏条件下，杂质B、杂质C及相对保存时刻0.714处有所增加，其他杂质均无明显变化；酸损坏条件下，杂质C及相对保存时刻0.714处不知道杂质有所增加，其他杂质均无明显变化，欲知此不知道杂质详细是什么物质，还有待进一步研讨。别的，经过安捷伦色谱工作站供给的“全波长法”剖析以上色谱图中，利伐沙班纯度指数值均>0.990，提示主峰均为单一物质峰，且降解产品峰、已知杂质峰均与主峰的别离度满意检测要求。

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[16]国家食品药品监督管理局.利伐沙班片进口注册规范JX 20080077[S].2009.

（收稿日期：2017-04-14 本文修改：祁海文）endprint