基因检测为什么被叫停 使用16SrRNA基因序列剖析快速判定临床标本中的革兰氏阳性杆菌
姚纲 胡红焱 梁慧等
[摘要] 意图 探究一种快速判定临床标本中革兰氏阳性杆菌的办法。 办法 使用PCR技能扩增待检菌株的16 S rRNA基因序列，经过剖析待检菌株的16 S rRNA基因序列对其进行判定。 成果 5株待检菌株的16 S rRNA基因序列均成功扩增，其间4株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列类似率达99.9%以上，将其判定到种的水平，1株的16 S rRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列类似率为97.09%，将其判定为雷弗森菌属。 定论 使用16 S rRNA基因序列剖析可快速、精确地判定临床标本中的革兰氏阳性杆菌。
[关键词] 16 S rRNA基因；细菌判定；革兰氏阳性杆菌
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）03（a）-0094-03
近年来，跟着人口老龄化、免疫危害宿主增加等要素的影响，革兰氏阳性杆菌感染的发病率有升高趋势[1-3]。常见的革兰氏阳性致病杆菌有单核细胞增生性李斯特菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌、诺卡菌、产气荚膜梭菌、困难梭菌以及炭疽杆菌等。革兰氏阳性杆菌感染其表型特征的敏感性及特异性较差，经过惯例查验手法对其进行快速、精确的判定比较困难。2012年3～10月，本研讨从临床标本中相继别离出5株革兰氏阳性无芽胞杆菌。为了快速、精确地判定这些菌株，笔者使用PCR技能对其16 S rRNA基因进行扩增，然后经过16 S rRNA基因序列剖析将其判定至属或种的水平。
1 资料与办法
1.1 资料
1.1.1 菌株 5株革兰氏阳性杆菌均别离自北京武警总医院各科临床标本，菌株编号分别为QC0411、QC0823、Y0720、Z0802、20983。
1.1.2 试剂 Chelex-100树脂（伯乐公司，美国），琼脂糖G-10（Gene公司，美国），溴乙锭（Promega公司，美国），Ex Taq聚合酶试剂盒及DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程大连有限公司。16 S rRNA基因的扩增选用16 S rRNA基因细菌通用引物（F：5′-AGAGTT-TGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[4]，引物由上海生工生物工程有限公司组成。
1.1.3 仪器 TC-312 PCR仪（Techne公司，英国），EPS-100核酸电泳仪（圣科仪器设备有限公司，上海），Gel Logic 100凝胶电泳成像仪（柯达公司，美国）。
1.2 办法
1.2.1 基因组DNA提取 参照文献[5]用Chelex-100法提取。
1.2.2 16 S rRNA基因扩增 16 S rRNA基因扩增反响体系由10×Ex Taq 缓冲液（Mg2+ Plus）5 μl、dNTP 混合物（各2.5 mmol/L）4 μl、引物F（10 μmol/L）及引物R（10 μmol/L）各2 μl、Ex Taq聚合酶 （5 U/μl） 0.25 μl、基因组DNA 4 μl组成，最后用无菌去离子水补足至50 μl。PCR反响条件为95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环后72℃延伸5 min。
1.2.3 扩增成果检测 取5 μl PCR产品于1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后经过凝胶电泳成像仪照相调查，承认方针基因扩增成功后，PCR产品送北京天一辉远生物科技公司测序。
1.2.4 同源性判定 将测得的16 S rRNA基因序列用Vector NTI Advance（v.11.5.1）序列剖析软件包进行人工校读，去除两头测序图谱不清简单引起混杂的序列，并对2个引物的双向测序成果进行拼接[6]。登陆GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）和核糖体工程数据库（http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp），将测得的各菌株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列进行同源性比对。
2 成果
2.1 16 S rRNA基因扩增成果
一切菌株的16 S rRNA基因均扩增成功，反响产品经电泳检测在约1500 bp处有一明晰条带，与预期意图片段长度相符（表1）。
3 评论
传统的细菌判定以别离培育为条件，然后根据其形态学、生理生化特征进行判定，从标本收集到得出清晰的判定成果往往需求3～4 d乃至更长时刻，且精确性不非常抱负，给临床及时辅导诊治带来必定的困难。微生物主动判定体系的推广使用使这一现象有所改观，但这种彻底根据表型特征的判定技能依然具有内涵的缺点。PCR扩增技能及DNA 分子测序技能的展开，为细菌在基因水平的判定供给了技能保证，16 S rRNA基因序列剖析已被广泛使用于细菌判定[7-8]。本研讨经过扩增、剖析待检菌株的16 S rRNA基因序列，对5株革兰氏阳性杆菌进行了快速、精确的判定，给临床及时诊治供给了牢靠的根据。
16 S rRNA基因序列提醒了物种间内涵的亲缘联系及其演化进程，现在已成为细菌判定的“金规范”。16 S rRNA基因序列全长约1550 bp，其核苷酸序列具有高度保存性，一起在保存区之间存在9～10个可变区，可变区在不同科、属、种间存在必定的变异，可经过比较不同细菌的16 S rRNA基因序列间的差异对其进行分类判定[8]。跟着PCR及主动化DNA测序技能的不断展开，细菌16 S rRNA基因序列剖析的研讨越来越老练。现在，简直一切病原菌的16 S rRNA基因均已完结测序并录入基因库[7]。Bosshard等[9]以为，16 S rRNA基因序列类似率>99%判定为同一个种，95%～99%判定为同一个属。本研讨中4株待检菌株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列类似率达99.9%以上，据此将其判定到种的水平；菌株Y0720的16 S rRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列类似率为97.09%，将其判定为雷弗森菌属。用此项技能判定临床标本中的细菌，从标本送检到得出判定成果，整个进程只需2～3 d，且判定目标单一、清晰，即以保存的16 S rRNA基因序列为基准，经过可变区序列的差异加以判定，而传统技能有必要归纳很多的目标才干判定[10]，所以，关于临床罕见细菌及非典型菌株的判定，16 S rRNA基因序列剖析可作为惯例判定办法的有力弥补，但由于原核生物的16 S rRNA基因序列具有高度保存性，故关于亲缘联系较近的种或同一种内不同菌株间的辨别分辨力有限，且基因扩增、测序只能在具有必定条件的组织和区域展开，因此约束了此项技能的使用。
[参考文献]
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[3] Moon JH，Cho WS，Kang HS，et al.Nocardia brain abscess in a liver transplant recipient[J].J Korean Neurosurg Soc，2011，50（4）：396-398.
[4] Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，et al.16 S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol，1991，173（2）：697-703.
[5] 姚纲，胡红焱，梁慧，等.Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA[J].今世医学，2013，（25）：15-17.
[6] Lu G，Moriyama EN.Vector NTI，a balanced all-in-one sequ-ence analysis suite[J].Brief Bioinform，2004，5（4）：378-388.
[7] Wellinghausen N，Kochem AJ，DisquéC，et al.Diagnosis of bacteremia in whole-blood samples by use of a commercial universal 16 S rRNA gene-based PCR and sequence analysis[J].J Clin Microbiol，2009，47（9）：2759-2765.
[8] 沈亚娟，夏云.16 S rRNA基因序列剖析判定非典型细菌的试验研讨[J].重庆医学，2013，42（1）：46-48.
[9] Bosshard PP，Abels S，Zbinden R，et al.Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic Gram-positive rods in the clinical laboratory （an 18-month evaluation）[J].J Clin Microbiol，2003，41（9）：4134-4140.
[10] 张志明，孙海英，李建平.16 S rRNA在医学微生物判定中的使用[J].世界查验医学杂志，2010，31（4）：349-350.
（收稿日期：2014-01-22 本文修改：许俊琴）
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（收稿日期：2014-01-22 本文修改：许俊琴）
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（收稿日期：2014-01-22 本文修改：许俊琴）