广金钱草 HPLC—MS/MS一起测定广金钱草中8种成分在大鼠胆汁中的浓度及其分泌动力学研讨
樊雪艳+王鑫+刘晓晨+王春英
[摘要] 树立一起测定灌胃给予大鼠广金钱草提取物后胆汁中7种黄酮和1种酚酸类化合物浓度的HPLC-MS/MS，并用于胆汁分泌研讨。大鼠灌胃给予广金钱草提取物后，别离在0～1，1～2，2～4，4～6，6～8，8～12，12～24 h时刻段搜集胆汁。色谱柱选用Diamonsil C18 column （4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温 40 ℃。以甲醇-0.01%乙酸水溶液为活动相，梯度洗脱，流速0.8 mL·min-1。质谱选用电喷雾离子源（ESI），负离子方式下检测，多反响离子监测（MRM）方式进行定量。成果标明8种成分在测定浓度范围内线性关系杰出（r≥0.991 5），日内、日间精细度RSD<15%，准确度RE-15%～15%，安稳性杰出。提取收回率>63.2%，内标归一化的基质因子RSD均未超越15%，符合要求。大鼠胆汁分泌研讨成果显现，8种成分在胆汁中的原型分泌率均比较小，而且不同个别之间不同较大。该研讨办法灵敏度高，挑选性好，样品处理简略，可用于灌胃给予大鼠广金钱草提取物后胆汁中8种成分的分泌动力学研讨。
[关键词] 广金钱草； 黄酮； 酚酸； HPLC-MS/MS； 含量测定； 胆汁分泌
[Abstract] To establish a HPLC-MS/MS quantitative method for analysis of 8 constituents in rat bile. The method was applied in the biliary excretion study after oral administration of Desmodii Styracifolii Herba extract. The rat bile samples were collected during 0-1， 1-2， 2-4， 4-6， 6-8， 8-12， 12-24 h. Diamonsil C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） was adopted and eluted with methanol and 0.01% acetic acid in a gradient mode. The flow rate was 0.8 mL·min-1， and the column temperature was set at 40 ℃. The detection was carried out by a triple quadrupole linearion trap mass spectrometer in the negative ion mode with an electrospray source. Multiple reactions monitoring （MRM） mode was employed. The calibration curves showed a good linearity， with correlation coefficients （r≥0.991 5） for all of the analytes within the concentration range. The intra-day and inter-day precisions （RSD） were both less than 15%， and the accuracies （RE） ranged from -15% to 15%. The method had a good stability， and was suitable for the content determination of 8 constituents in rat bile. The extraction recoveries of the 8 analytes were more than 63.2%， and the RSD of IS-normalized matrix factors were no more than 15%， which met the requirements for analysis. According to the biliary excretion study， the bile excretion rates of the 8 analytes were relatively low， with great difference among the individuals. The results showed that the established method was simple， selective and specific， thus could be applied in the biliary excretion study of the 8 analytes in rat bile.
[Key words] Desmodii Styracifolii Herba； flavonoids； phenolic acid； HPLC-MS/MS； content determination； biliary excretion
廣金钱草为豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的枯燥地上部分[1]，是我国常用的传统中药，具有清热排石、利胆利尿、抗炎镇痛的成效，可用于防备、医治泌尿体系结石以及结石术后消炎止痛等 [2-3]。广金钱草中含有黄酮、酚酸、多糖、生物碱、鞣质、挥发性成分等[4]。其间，黄酮类成分可以显着削减高草酸尿大鼠肾结石的构成[5]，酚酸则具有抗炎的效果[6]。为更好的辅导其临床使用，本课题组在对广金钱草在大鼠体内的药物代谢动力学研讨的根底上[7]，进一步对其在大鼠体内的分泌进行研讨。旨在树立一种HPLC-MS/MS一起测定广金钱草中7种黄酮和1种酚酸类化合物在大鼠胆汁中的浓度，然后调查其胆汁分泌的动力学进程，为全面研讨广金钱草的体内进程奠定根底。
1 资料
1.1 仪器
Agilent-1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BP211D型1/10万天平（德国Sartorius公司）；3200Q TRAP型三重四极杆线性离子阱质谱仪，配有ESI离子源（美国AB公司）；MTN-2800D型氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；Analyst 1.5.2 software数据体系（美国AB公司）；N1001旋转蒸腾仪（上海爱朗仪器有限公司）。
1.2 试药与试剂
阿魏酸 （0773-9910），磺胺甲噁唑（IS）（100025-199503） 购于我国食品药品检定研讨院；夏佛塔苷 （ZL25854XFT），异夏佛塔苷（ZL85428YXF），甘草素（ZL68515GCS），芹菜素（ZL10852QCS），柚皮素（ZL78156YPS），异鼠李素 （110860-200406），异牡荆素（ZL95565YMJ） 均购于南京泽朗医药科技有限公司。各物质结构见图1。甲醇为色谱纯（美国J T Baker公司）；超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为剖析纯（天津化学试剂公司）。广金钱草药材购于河北安国。
1.3 动物
试验动物为Wistar大鼠，清洁动物，体质量240～250 g，雄性，河北医科大学试验动物中心供给，合格证号为603242。试验前禁食12 h，自在饮水。
2 办法与成果
2.1 色谱条件
色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），活动相为甲醇 （A） 和 0.01%乙酸水溶液 （B），梯度洗脱条件：0～34 min，20%～34% A；34～38 min，34%～95% A；38～42 min，95% A。流速0.8 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量20 μL。
2.2 质谱条件
离子源为Turbo V电喷雾离子化源（ESI）；源温度为650 ℃；选用多反响离子监测（MRM）方式进行负离子检测；源喷发电压（IS）为-4 500 V；雾化气（GS1，N2）压力为60 psi（1 psi=6.895 kPa）；辅佐气（GS2，N2）压力为65 psi；气帘气（N2）压力为25 psi。各物质的MS和MS2离子碎片数据，解簇电压（DP）和磕碰能量（CE）见图1。内标磺胺甲噁唑 m/z 252.0→155.9，保存时刻为10.94 min。
2.3 对照品溶液的制备
精细称取8个对照品及内标适量，用20%甲醇溶解制成混合对照品溶液，使对照品的质量浓度别离为10 400，424，344.4，71.2，24，23.4，20.4，118.4 mg·L-1，内标磺胺甲噁唑为 0.525 mg·L-1。将混合对照品溶液用20%的甲醇别离稀释成1∶0，1∶5，1∶10，1∶100，1∶200，1∶500，1∶1 000的系列规范溶液。一起将混合对照品溶液用20%甲醇稀释成1∶2.5，1∶20，1∶800的溶液用于制备QC样品。
2.4 广金钱草提取物的制备
取已切碎的广金钱草药材（批号1008016）200 g，参加50%乙醇回流提取3次（1∶15，1∶15，1∶10），每次1 h。第1次提取前浸泡1 h，兼并提取液，过滤，收回乙醇并浓缩至20 mL。用外标法测得该提取物中夏佛塔苷、异夏佛塔苷、阿魏酸、甘草素、芹菜素、柚皮素、异鼠李素、异牡荆素的质量浓度别离为1.701，0.386，0.015，0.001，0.024，0.012，0.031，0.234 g·L-1。
2.5 胆汁样品搜集与处理
胆汁样品搜集：取Wistar大鼠6只，按4 mL·kg-1灌胃给予广金钱草提取液，25%乌拉坦7 mL·kg-1腹腔麻木，施行胆管插管手术。搜集0～1，1～2，2～4，4～6，6～8，8～12，12～24 h的膽汁，-20 ℃冷藏。胆汁样品处理：取胆汁0.4 mL，加甲醇20 μL，内标溶液20 μL，盐酸（0.25 mol·L-1）50 μL，涡旋3 min，再加乙酸乙酯1.2 mL，涡旋5 min混匀，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液1.2 mL。N2吹干，用50%甲醇100 μL复溶，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样剖析。
2.6 办法学验证
2.6.1 挑选性调查 经过比较实践生物样品，模仿生物样品，空白生物基质来调查内源性物质和代谢产品的搅扰。给药后搜集的胆汁样品、LLOQ规范增加胆汁样品及空白胆汁的典型MRM色谱图，见图2。成果标明胆汁中的内源性物质和代谢产品均不搅扰内标物和待测物测定。
2.6.2 规范曲线和定量下限（LLOQ） 取空白胆汁400 μL，别离参加内标溶液20 μL，系列规范溶液20 μL，盐酸溶液50 μL，依照2.5项下处理，记载内标和待测物的峰面积。以待测物与内标峰面积的比值为纵坐标，以待测物的质量浓度为横坐标，制作规范曲线。用加权最小二乘法（W=1/χ2）核算回归方程。LLOQ为规范曲线上最低浓度点，接连测定6份。8种待测物的规范曲线和LLOQ见表1。成果各成分相关系数（r）均大于0.991 5，阐明大鼠胆汁中8种成分在测定质量浓度范围内线性关系杰出。LLOQ的准确度RE和精细度RSD均小于15%。
2.6.3 精细度和准确度 取空白胆汁，别离参加内标溶液20 μL，制备QC样品用的规范溶液20 μL，盐酸溶液50 μL，依照2.5项下处理，记载内标和待测物的峰面积。高、中、低3个浓度的QC样品各平行测定6份，用当日随行的规范曲线测定QC样品的质量浓度，核算日内精细度和准确度。接连进行3 d，别离以当日的规范曲线核算QC样品的质量浓度，核算日间精细度和准确度。日内和日间精细度和准确度见表2。成果标明，胆汁样品中各待测成分日内、日间精细度RSD<15%，准确度RE ±15%，标明本办法准确度高、精细度好，符合要求。
2.6.4 提取收回率与基质效應 按2.6.3项测定低、中、高 3 个浓度的质控样品各6份，记载待测物和内标的峰面积（A）。别的，取空白基质400 μL，按2.5项下处理至N2吹干，精细参加制造质控样品用的规范溶液20 μL和内标溶液20 μL，N2吹干，50%甲醇100 μL复溶，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样剖析，记载待测物和内标的峰面积（B）。提取收回率=A/B×100%。取来历不同的6批空白基质各400 μL，按2.6.3项办法测定高、中、低3个浓度时待测物和内标的峰面积（C）。一起测定不含基质时待测物和内标的峰面积（D），核算各剖析物与内标的基质因子=C/D×100%，再核算出每一剖析物经内标归一化的基质因子与其RSD。胆汁中每种被剖析物的提取收回率、经内标归一化的基质因子与RSD见表2。成果标明8种剖析物的提取收回率均大于63.2%，经内标归一化的基质因子RSD均小于15%，标明本试验办法的提取收回率较高，而且基质效应不影响胆汁中8种成分的浓度测定。
2.6.5 安稳性 取空白基质，制备高、中、低3个浓度的QC样品，每浓度3份，调查样品在室温下12 h的短期安稳性、-20 ℃贮存30 d的长时刻安稳性、经3次重复冻融循环后（-20 ℃～20 ℃）的安稳性。胆汁的短期安稳性、长时刻安稳性以及3次冻融循环的安稳性，见表3。成果标明胆汁样品安稳性杰出。
2.6.6 稀释可靠性 取空白基质参加高浓度对照品溶液适量制造成待调查样品，用空白基质稀释10，100，500倍，每个浓度平行制造5份，按2.5项下处理，进样剖析，并核算准确度与精细度。成果显现，8种待测物浓度的精细度RSD均小于15%，准确度RE -9.7%～12.3%，标明试验进程中稀释样品不影响待测物浓度的测定。
2.7 胆汁分泌动力学特征
按2.5项下操作，测定胆汁样品，并以随行规范曲线核算各时段样品中各待测物的浓度，依据相应时段的分泌体积核算分泌量，以时刻点为横坐标，累积分泌量为纵坐标，制作各成分的累积分泌量-时刻曲线，见图3。以时刻为横坐标，分泌速率为纵坐标，制作均匀分泌速率-时刻曲线，见图4。累积分泌量与给药剂量比较，即得该成分的累积分泌率。在0～24 h 内，大鼠胆汁样品中8种化合物以原型在胆汁中的累积分泌率别离为柚皮素（0.047±0.01）%，阿魏酸（1.145±0.46）%，异牡荆素（0.007±0.004）%，夏佛塔苷（0.998±0.24）%，异夏佛塔苷（0.015±0.01）%，芹菜素（0.043±0.018）%，异鼠李素（0.010±0.006）%，甘草素（0.147±0.075）%。成果标明8种成分在胆汁中的原型分泌率较低，而且不同个别之间不同较大。
3 评论
本研讨将所有待测物在正负离子检测方式下所取得的质谱信息进行比较发现，所有待测物在负离子方式下灵敏度高且安稳，故挑选负离子方式进行定量剖析。除此之外，对不同的活动相体系进行调查，终究发现在以甲醇-0.01%乙酸水溶液为活动相，选用梯度洗脱的试验条件下，8种待测剖析物可以彻底分隔，且峰形好，响应值高。因而挑选甲醇-0.01%乙酸水溶液为活动相。
本研讨成果标明8种成分在胆汁中的原型分泌率均较低。本课题组曾对广金钱草提取物在大鼠体内的药动学进行了研讨[7]，8种成分中只取得了夏佛塔苷、异牡荆素、芹菜素和阿魏酸的完好药时曲线，而其他成分或许因为存在较强的首过效应，进入血液循环的量十分少，血浆浓度十分低，在胆汁中主要以代谢产品方式存在，原型较少。文献[7-8]研讨标明，阿魏酸比黄酮类消除快，且较简单吸收，可在体内发作广泛的生物转化，生成相应的代谢产品，且与胆汁中的分泌速率比较，阿魏酸在尿液中分泌速率更快，上述原因可导致阿魏酸在大鼠胆汁中分泌速率低、原型累积量少。关于柚皮素已有文献报导[9]，柚皮素在胆汁中主要以代谢产品方式存在，原型较少；在尿液中各代谢产品相对量的总和与原型的适当；粪中的各代谢产品相对量十分低，简直悉数以原型的方式分泌。阐明导致柚皮素胆汁分泌率低的原因除首过效应发作代谢外，还有或许是胃肠道吸收欠好。芹菜素在胆汁中消除慢、原型分泌量少，分泌速率显着低于尿液，且大部分以结合物方式排出[10-11]，该定论与本试验成果根本共同。有文献标明[12-13]，夏佛塔苷等黄酮苷类化合物在胆汁中的原型分泌率均较低，相同成分在尿液中的分泌率稍高些，分泌物大多为化合物的代谢产品，少数以原型排出，该成果可用来解说本研讨中黄酮苷类化合物胆汁中的原型分泌量少的原因。本研讨论述了广金钱草中的7种黄酮和1种酚酸类化合物在大鼠胆汁中的分泌规则，提示其在大鼠体内存在广泛的代谢进程或其他分泌途径，后续可进跋涉一步的调查与研讨。
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[责任编辑 张燕]