决明子提取物 决明子萘并吡喃酮类对照提取物研讨及其在决明子药材质量操控中的使用

周德勇　骆宜　苏磊　姜艳艳　刘斌

[摘要] 树立以决明子萘并吡喃酮类对照提取物为对照的决明子药材质量操控办法，评论对照提取物在中药质量操控中运用的可行性。选用色谱别离技能制备决明子萘并吡喃酮类对照提取物，以决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷及决明子苷C对照品为对照，对决明子萘并吡喃酮类对照提取物进行标定。以已知含量的对照提取物为对照，树立决明子药材HPLC含量测定办法，并与以对照品为对照的含量测定成果进行比较，成果标明，2种含量测定办法无显着差异。该成果为决明子萘并吡喃酮类对照提取物在决明子药材质量操控中的运用供给科学依据，为中药对照提取物代替单一对照品进行中药质量操控奠定根底，为中药质量操控供给新的研讨思路和形式。

[关键词] 决明子； 对照提取物； 萘并吡喃酮； 质量操控； 运用

Study on naphthopyrone reference extract and application on

assay of Semen Cassiae

ZHOU Deyong1， LUO Yi1， SU Lei1， JIANG Yanyan1，2*， LIU Bin1*

（1. School of Chinese Pharmacy， Beijng University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Quality Control Technology and Engineering Center of Chinese Medicine， Beijing Municipal

Commission of Education， Beijing 100102， China）

[Abstract] A quality control method of Semen Cassiae was established by using naphthopyrone reference extract（NRE）. Meanwhile， the feasibility about NRE replacing single component reference in quality control of traditional Chinese medicine was explored. After NRE of Semen Cassiae being prepared by chromatographic separation technology， we determined the three main components， cassiaside B2， rubrofusarin6OβDgentiobioside and cassiaside C. In the meantime， an HPLC analytical method， based on the NRE as standard substance， was developed to determinate the contents of three main components in Semen Cassiae. Ttest was used for comparison of the determination results of the two methods（single chemical component and NRE as reference substances， respectively）， and the Ttest result demonstrated that there was no significant difference between the two methods. The results developed scientific basis for the application of NRE of Semen Cassia in the quality control， which could be applied for the quality control of traditional Chinese medicine using reference extract substituting single chemical reference， and provide a new research model for the quality control of Chinese medicine.

[Key words] Semen Cassiae； standard reference extract； naphthopyrone； quality control； application

中藥质量操控与点评是中药研讨范畴的重要科学问题，现行中药质量操控办法首要以单一化学成分为对照品，从定性和定量视点对中药及复方进行质量操控。这种以单一化学成分表征中药全体质量的形式无法真实操控和点评中药质量，与中医药全体观亦不相符，在必定程度上阻止了中药现代化、国际化的进程。中药成分的复杂性决议了以单一成分或目标成分为对照难以客观点评中药质量，但是，多目标成分的质量点评形式却遭到中药化学对照品别离难度大、单体安稳性差或试验本钱高级要素的限制[1]。针对这一问题，有研讨者[23]提出了一测多评法，该办法可在必定程度上处理中药多成分一起定量的一些问题，但一起该办法在相对校对因子的定量、目标成分的色谱峰定性，尤其是办法的适用性和耐用性方面尚存在一些问题。因而，树立契合中药多成分特征的新办法是处理中药质量操控问题的有用途径。

中药对照提取物是指首要化学成分及其含量清晰、安稳性好、纯度较高的中药提取物，其化学成分组分份额相对固定，目标性成分含量已选用相应的对照品进行标定，可以完成一起对多个组分进行定性和定量剖析，不光制备办法相对简略、本钱较低，并且后续质量操控进程相对简练、试验过程相对简洁，用于中药材多成分剖析，可节省资源，下降查验本钱[4]。如2015年版《我国药典》收载了银杏叶片剂2 种可供挑选运用的含量测定办法，若运用化学对照品进行含量测定，则需运用槲皮素、山柰素、异鼠李素等7种化学对照品，若运用已标定的2种银杏叶对照提取物进行含量测定，本钱将大大下降，一起可以削减单体对照品的运用，削减试验过程和试验本钱[5]。因而，中药对照提取物的研制与运用不只可以处理中药质量操控中本钱高、安稳性差、重现性差等许多问题[68]，并且为更科学、合理、体系的展开中药质量操控，供给新的研讨办法和研讨形式。endprint

决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明C. tora L.的枯燥老练种子，具有清肝明目、润肠通便的成效，临床多用于医治目赤涩痛、头痛晕厥、目暗不明、大便秘结等[9]。决明子中首要含有蒽醌类化合物和萘并吡喃酮类化合物[1012]，此外，还含有多糖、蛋白质、脂肪酸以及多种微量元素。2015年版《我国药典》以大黄酚和橙黄决明素为目标对其进行质量操控，但是，蒽醌类化合物并非决明子中专特点化学成分，且含量较低，因而，以其为对照品进行质量操控，难以全面、科学的反映决明子药材质量[5]。文献及前期研讨成果标明，萘并吡喃酮類化合物在决明子药材中的含量显着高于蒽醌类成分，且具有保肝、降血脂等效果[1314]，是决明子中的重要药效物质根底。因而，制备决明子萘并吡喃酮类对照提取物[15]，并以其为对照物质，树立根据萘并吡喃酮类对照提取物的含量测定办法，可以清晰对照提取物在决明子质量操控中的适用性和可行性，提高决明子药材质量操控办法的科学性和专特点，处理萘并吡喃酮类成分决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷及决明子苷C对照品稀缺、价格昂贵等问题，一起为树立科学合理的决明子药材质量规范奠定根底。

1 资料

SHBⅢ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；KQ500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Waters高效液相色谱仪，包含1525型二元高压梯度泵体系，2998型DAD检测器，2414型柱温操控体系，2707型自动进样体系，Breeze色谱工作站（美国Waters公司）；Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Sartorious BT 25S型1/10万电子剖析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher公司）；屈臣氏纯净水；其他试剂均为剖析纯。

对照品决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷及决明子苷C均为克己，经1H，13CNMR判定结构，HPLC检测，峰面积归一化法核算，纯度均大于98%。

决明子药材均购于北京同仁堂，经北京中医药大学中药学院刘春生教授判定为决明C. obtusifolia的枯燥老练种子。

2 办法与成果

2.1 决明子萘并吡喃酮类对照提取物的研讨

2.1.1 对照提取物制备

决明子药材，10倍量30%乙醇回流提取3次，每次2 h，兼并提取液，减压收回溶剂至无醇味，水涣散，AB8型大孔树脂纯化，顺次用水、20%乙醇、50%乙醇洗脱，搜集50%乙醇洗脱部位，收回溶剂，蒸干后，得到决明子半制备组分Ⅰ。将半制备组分Ⅰ与硅胶（3∶5）均匀拌样，于80 ℃ 真空枯燥，以拌样硅胶与空白硅胶1∶13干法上样，氯仿甲醇水（6.5∶3.5∶0.6）洗脱，洗脱完成后将干柱分红20部位，兼并2～7，11～17硅胶，加甲醇洗脱，收回溶剂，蒸干后，得到决明子半制备组分Ⅱ。将半制备组分Ⅱ经过ODS柱纯化，以甲醇乙腈（2∶1）混合溶液为A相，以水为B相进行梯度洗脱，洗脱程序为30% A（2倍柱体积）， 33% A（1倍柱体积）， 36% A（1倍柱体积）， 39% A（1倍柱体积）， 42% A（1倍柱体积）， 45% A（1倍柱体积），经过薄层色谱法检识，兼并含有目标成分的洗脱液，收回溶剂，减压枯燥，即得决明子萘并吡喃酮类对照提取物。

2.1.2 对照提取物标定

以决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C对照品为对照，测定决明子萘并吡喃酮类对照提取物中3个目标成分的含量。

2.1.2.1 色谱条件 色谱柱SunFire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；活动相甲醇乙腈（2∶1）混合溶液（A）水（B）梯度洗脱（0～35 min， 31% A；35～45 min，31%～37% A；45～50 min，37%～42% A）；流速1 mL·min-1；检测波长278 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。在此色谱条件下，混合对照品和对照提取物色谱图见图1。

2.1.2.2 对照品溶液制造 精细称取决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C对照品适量，别离制得每1 mL含0.053 52 mg决明子苷B2，0.079 56 mg红镰霉素6OβD龙胆二糖苷，0.069 84 mg决明子苷C的混合对照品溶液，再用纯甲醇稀释成一系列不同浓度的混合对照品溶液。

2.1.2.3 供试品溶液制造 精细称取决明子萘并吡喃酮类对照提取物3.00 mg，置于25 mL量瓶中，加30%甲醇超声溶解，静置，定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2.4 线性联系调查 取2.1.2.2项的不同浓度混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 μL注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。以对照品进样量（X）为横坐标，色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得出回归方程，成果见表1。

2.1.2.5 精细度调查 取2.1.2.3项决明子供试品溶液，每次汲取10 μL注入液相色谱仪，接连进样6次，以决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C色谱峰峰面积核算RSD，成果别离为0.54%， 0.72%， 0.61%，标明仪器精细度杰出。

2.1.2.6 安稳性试验 取2.1.2.3项决明子供试品溶液，别离于制备后0， 2， 4， 6， 8， 12， 24 h进样，测定决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C色谱峰峰面积，核算RSD别离为0.96%， 1.1%， 0.98%，标明供试品溶液在24 h内根本安稳。

2.1.2.7 重复性试验 别离精细称定决明子萘并吡喃酮类对照提取物6份，按2.1.2.3项办法制备供试品溶液，别离进样，测定峰面积，核算决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C的RSD，成果别离为1.2%， 1.1%， 1.2%，标明该办法重复性杰出。endprint

2.1.2.8 加样收回率试验 别离精细称定决明子萘并吡喃酮类对照提取物6份，参加必定量的对照品溶液，按2.1.2.3项办法制备供试品溶液，别离进样，测定峰面积，并核算3个目标成分的加样收回率及RSD。成果决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C的加样收回率别离为98.36%，102.8%，100.8%，RSD别离为1.7%，1.3%，1.5%。

2.1.2.9 对照提取物标定 取3批克己决明子萘并吡喃酮类对照提取物，精细称定，按2.1.2.3项制备样品溶液，测定并核算各样品中3个目标性成分的含量，成果3个成分的总含量均高于60%，3批对照提取物含量标定成果见表2。

2.1.3 对照提取物安稳性调查

选用2.1.2.1项的HPLC含量测定办法，调查决明子萘并吡喃酮类对照提取物的安稳性。对照提取物经制备后，常温避光保存，进行6个月安稳性试验，别离于第0， 1， 2， 3， 6个月抽样检测，剖析样品中决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C含量，成果见表3，3个目标性成分的RSD别离为0.24%，0.25%，0.15%，均小于1%，标明决明子萘并吡喃酮类对照提取物在6个月内具有杰出的安稳性。

2.2 对照提取物在决明子药材质量操控中的运用

以决明子萘并吡喃酮类对照提取物为对照，测定决明子药材中决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷及决明子苷C等3个成分的含量，并与单体对照品测得的成果进行比较，调查对照提取物用于药材质量操控的科学性和可行性。

2.2.1 色谱条件

选用2.1.2.1项条件，对照提取物和供试品色谱图见图2。

2.2.2 对照提取物溶液制备

精细称取已标定含量的决明子萘并吡喃酮类对照提取物6.12 mg，置10 mL量瓶中，加30%甲醇超声溶解，静置，摇匀，30%甲醇稀释至刻度，制得每1 mL含0.122 0 mg决明子苷B2，0.131 5 mg红镰霉素6OβD龙胆二糖苷，0.147 3 mg决明子苷C的母液。精细汲取母液1 mL，转移至10 mL量瓶中，加30%甲醇稀释，定容，摇匀，制成每1 mL含0.012 20 mg决明子苷B2，0.013 15 mg红镰霉素6OβD龙胆二糖苷，0.014 73 mg决明子苷C的对照提取物溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

取决明子药材粉末（20目）60 mg，精细称定，置具塞锥形瓶中，精细参加甲醇25 mL，称重，超声处理（100 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.4 办法学调查

2.2.4.1 线性联系调查 精细汲取2.2.2项不同体积的决明子萘并吡喃酮类对照提取物溶液，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。以对照品进样量（X）为横坐标，色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得出回归方程，见表4。

2.2.4.2 精细度调查 取决明子药材粉末（20目）60 mg，精细称定，按2.2.3项制得供试品溶液，接连进样六次，每次10 μL，以色谱峰峰面积核算RSD，见表5。

2.2.4.3 安稳性调查 取2.2.3项决明子供试品溶液，别离于制备后0，2，4，6，8，12，24，48，72 h进样，测定决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C色谱峰峰面积核算RSD，见表5。

2.2.4.4 重复性调查 取同一批决明子粉末（20目）6份，每份60 mg，精细称定，按2.2.3项办法制备供试品溶液，测定色谱峰峰面积，并核算RSD，见表5。

2.2.4.5 加样收回率调查 取已知含量的决明子药材粉末（20目）（决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C的量别离为0.394 1%，0.317 9%，0.629 8%）6份，每份30 mg，精细称定，别离置于25 mL具塞锥形瓶中，精细参加2.2.2项决明子萘并吡喃酮类对照提取物母液1 mL，按2.2.3项办法制备供试品溶液，别离精细汲取10 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。核算决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C苷收回率及RSD，见表6，RSD均小于3.0%，标明该办法收回率杰出。

2.2.5 决明子药材含量测定

取20批决明子药材粉末（20目），精细称定，按2.2.3项制备供试品溶液，别离以决明子萘并吡喃酮类对照提取物和单体对照品为对照，测定决明子苷B2、紅镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C的含量。选用配对t查验法比较决明子2种含量测定办法成果间的差异性，2种办法之间无显着性差异，标明对照提取物法与对照品法所得测定成果具有一致性。因而，决明子萘并吡喃酮类对照提取物可有用代替单体对照品进行决明子质量点评，见表7。

3 小结与评论

跟着对中药研讨的深化和开展，中药质量操控研讨已不再满足于只是到达定量精确这一根本要求，树立多目标成分同步剖析的形式已经成为中药质量操控的重要开展方向，研讨和开发中药对照提取物正是适应了这一开展趋势。对照提取物具有相对固定的化学组成，其定量目标与原药材的量化联系清晰，专特点较强，一起具有安全、安稳的理化特性，适用于树立多目标点评体系。因而，中药对照提取物将在中药质量点评中取得宽广的运用远景。

现在决明子及其一系列相关制品的质量操控首要是经过水解蒽醌苷，测定其水解产品大黄酚及橙黄决明素的含量来完成质量操控，不能反映其真实情况。本文在前期对决明子萘并吡喃酮类对照提取物制备办法研讨根底上，制备出含量清晰的对照提取物，树立了根据萘并吡喃酮类对照提取物的决明子药材含量测定办法，并别离选用对照提取物法和对照品法对决明子药材进行剖析测定，成果显现对照提取物可代替单体对照品完成对决明子药材的科学质量操控，该质量操控形式更契合中药多成分的特征，一起使中药质量操控更合理、体系、简洁。本研讨为决明子萘并吡喃酮类对照提取物进一步运用于含有决明子复方制剂的质量操控奠定了坚实的根底，为中药质量操控新形式的树立供给科学依据。endprint

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[责任编辑 丁广治]endprint