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积雪草酸 PEG化脂质纳米粒促进积雪草酸口服吸收研讨

点击:0时间:2021-03-01 01:11:55

张雅雯 尹丽娜 黄夏樱 梁泽华 陈晓晓 王胜浩

[摘要]选用溶剂涣散法制备聚乙二醇润饰的积雪草酸(asiatic acid,AA)纳米结构脂质载体(pegylated asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers,pAANLC),以结扎肠循环模型调查其在小肠的吸收散布状况,HPLC检测健康SD大鼠灌胃给予pAANLC后的胆汁药物浓度,直接点评PEG化脂质纳米粒的促口服吸收效果。成果显现,经PEG亲水性润饰的NLC在小肠黏膜的穿透才能大大进步,小肠内的转运量明显添加,大鼠体内药物分泌峰值Cmax较一般纳米粒(asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers,AANLC)进步了76%,达峰时刻tmax减慢,消除半衰期t1/2延伸1倍,AUC0→t为AANLC组的15倍,提示AANLC经PEG亲水性润饰后,口服生物利费用明显进步。

[关键词]积雪草酸; 纳米结构脂质载体; 聚乙二醇; 口服吸收

[Abstract]A solvent diffusion method was used to prepare pegylated asiatic acid (AA) loaded nanostructured lipid carriers (pAANLC), and the ligated intestinal circulation model was established to observe the absorption and distribution in small intestine The concentration of AA in bile after oral administration of pAANLC was detected by HPLC in healthy SD rats to indirectly evaluate the oral absorption promoting effect of PEGmodified namoparticles The results showed that the penetration of pAANLC was enhanced significantly and the transport capacity was increased greatly in small intestinal after PEG modification As compared with the normal nanoparticles (AANLC), the Cmax of the drug excretion was increased by 76%, the time to reach the peak (tmax ) was decreased and the elimination halflife t1/2 was doubled in the rats after oral administration of pAANLC, and the AUC0→t was 15 times of the AANLC group, indicating that the oral bioavailability of AANLC was significantly improved by hydrophilic modification of PEG

[Key words]asiatic acid; nanostructured lipid carrier; PEG; oral absorption

積雪草酸(asiatic acid,AA)为伞形科积雪草属植物积雪草Centella asiatica L Urban的有效成分之一,归于五环三萜酸,具有医治皮肤伤口、护肝、抗炎、抗肿瘤等多种药理效果[14],其代谢产品首要经胆汁分泌。AA水中溶解度极小,胃肠道吸收差,体内消除较快,口服生物利费用低[5]。本实验室前期制备了积雪草酸纳米结构脂质载体(asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers,AANLC),但生物利费用改进不明显[6],这或许与粒子易被高度黏弹性、附着性的肠道黏膜阻挠而无法进入体循环有关[78]。

聚乙二醇(PEG)是一种无毒、无免疫原性及抗原性化合物,被FDA同意可用于打针液、口服制剂。纳米脂质载体经低分子量的PEG(如2 kDa)润饰后,可进步粒子的亲水性,下降静电效果与网状内皮体系的铲除速率,进步某些药物的相对生物利费用[911]。因而,本研讨以聚乙二醇单硬脂酸酯(PEG2000SA,简称PEG)为润饰资料,制得亲水性的积雪草酸纳米结构脂质载体(pegylated asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers,pAANLC),经过比较润饰前后纳米粒在小肠的吸收散布差异和在体内的吸收特色,开始点评亲水性润饰纳米粒改进AA口服吸收的效果。

1仪器与资料

11仪器

LC20AD型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司);电子天平(AL104,梅特勒托利多仪器(上海)有限公司);激光共集合显微镜(LSM710,Zeiss);NanoZS90粒径与外表电位剖析仪(Malvern Instruments Ltd,UK);JY922D超声波细胞破坏仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);LGJ10D冷冻枯燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)。

12药品与试剂

AA(广西昌洲天然产品开发有限公司,纯度>99%,批号20080625);甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA,内标,上海晨易生物科技有限公司,纯度>99%,批号200600509);AANLC与pAANLC(实验室克己);PEG(PEG2000SA,Tokyo Chemical Industry,Japan);硬脂胺异硫氰酸荧光素(ODAFITC,实验室克己);硫酸酯酶(效价23 500 U·g-1)和葡醛酸酶(效价1万 U·mg-1)均购自SigmaAldrich;甲醇、乙腈(色谱纯,Merck KGaA,Germany),其他试剂均为剖析纯。

13动物

清洁级雄性SD大鼠,体质量(200±20) g,浙江省实验动物中心供给,合格证号SCXK(浙)20140001。

2办法与成果

21pAANLC的制备与点评

211纳米粒的制备

以单硬脂酸甘油酯与油酸为脂质资料,依照文献办法[12]制备pAANLC。即精细称取10 mg油酸,40 mg单硬脂酸甘油酯,适量PEG及药物AA,溶于3 mL无水乙醇中,70 ℃水浴下加至同温度水中,500 r·min-1机械拌和5 min后,得带乳光的纳米涣散液。该涣散液经减压浓缩、冻干,可得固体粉末。以ODAFITC作为荧光符号物代替AA,同法制备荧光符号的纳米粒(NLC与pNLC)。

212纳米粒的理化性质点评

2121粒径巨细与外表电位纳米涣散液,以水为涣散介质,超声涣散,用NanoZS90粒径与外表电位剖析仪测定pAANLC粒径为(1112±29) nm,外表电位为(-371±09) mV(n=3)。

2122包封率和载药量参阅文献办法[12]测定包封率(entrapment efficiency,EE)和载药量(drugs loading efficiency,DL),所选用的色谱办法专特点、准确度和精细度杰出。精细称取纳米粒冻干粉末(W0),以30%乙醇溶液为涣散介质,超声涣散,得涣散液。①取该涣散液适量,2万 r·min-1离心5 min,精细移取上清液适量,无水乙醇稀释,045 μm微孔滤膜过滤,HPLC测定游离药物量(Wfree)。②精细移取涣散液適量,无水乙醇稀释,于70 ℃水浴保温30 min,冷却至室温,045 μm微孔滤膜过滤,HPLC测定续滤液中总药物量(Wtotal)。依照公式(1)与公式(2)核算可得,pAANLC包封率为(911±05)%,载药量为(154±02)%(n=3)。

包封率=(Wtotal-Wfree)/W投药量×100% (1)

载药量=(Wtotal-Wfree)/W0×100% (2)

22大鼠肠道吸收散布调查

221实验计划

选用结扎肠循环模型[7]点评NLC及pNLC在小肠的吸收状况。取天然饮水条件下禁食12 h的雄性SD大鼠腹腔打针戊巴比妥钠溶液麻醉(40 mg·kg-1),背位固定,沿腹中线翻开腹腔,当心别离出空肠段,用37 ℃ KrebsRinger溶液冲洗肠内容物,别离注入高、低2档浓度的NLC,pNLC(100,200 mg·L-1,1 mL),将肠管两头结扎,放回大鼠腹腔,2 h后将大鼠处死,取出相应的肠段,冲洗肠段内容物及未被吸收的药物。肠段经冷冻包埋液包埋,冷冻切片及DAPI染色后,用激光共集合显微镜调查纳米粒在大鼠小肠的散布状况。

222纳米粒肠道吸收状况

为使纳米粒在小肠的吸收愈加可视化,本研讨选用双荧光符号法进行,即纳米粒用ODAFITC进行符号(绿色),小肠细胞核以DAPI试剂染色(蓝色)。将纳米粒溶液注入小肠管后,或许会发作3种状况:停留于小肠管;粘附于黏液纤维上,无法穿过黏液层;穿过黏液层而且进入小肠上皮细胞。

2种纳米粒在小肠微绒毛散布的激光共集合图(图1),蓝色荧光代表小肠细胞的细胞核,绿色荧光为纳米粒。成果显现,NLC的绿色荧光只出现在小肠微绒毛的边际,当进步纳米浓度,依然只要极少量的粒子透过微绒毛;而经亲水润饰的pNLC能较顺畅的穿过小肠微绒毛上的黏液层,且跟着纳米浓度的增大,透过黏液层的纳米粒越多,进入到细胞核内部的量也更多。

23大鼠口服吸收的开始点评

231实验计划

取健康雄性SD大鼠10只,分红2组,每组5只,禁食过夜(不由水)。戊巴比妥钠麻醉,背部固定,沿腹中线翻开腹腔,胆总管插管,并结扎固定,缝合创伤,搜集空白胆汁,待动物清醒后以50 mg·kg-1的剂量别离灌胃给予AANLC与pAANLC涣散液(药物质量浓度约5 g·L-1),于给药后0~1,1~2,2~3,3~4,4~5,5~6,6~8,8~10,10~12,12~24 h搜集胆汁,记载胆汁体积。

232胆汁样品的处理

精细移取GA溶液25 μL置枯燥试管中,氮气吹干,残渣用不同时刻胆汁样品50 μL溶解,用002 mol·L-1乙酸调至pH 5,参加硫酸酯酶(011 U·μL-1)和葡醛酸酶(25 U·μL-1)各10 μL,混匀,37 ℃水浴下酶解24 h后当即取出12 000 r·min-1,离心5 min。将上清液移至另一试管,参加甲基叔丁基醚1 mL提取,涡旋5 min,12 000 r·min-1,离心5 min,取上清液氮气吹干。残渣参加EDC·HCl溶液和对甲苯胺溶液适量衍生化3 h,氮气吹干,残余物用甲醇乙腈水(375∶375∶25)100 μL溶解,混匀,12 000 r·min-1,离心5 min,汲取上清液进样剖析。

233标准溶液的制造

别离精细称取AA和GA 50 mg,各置50 mL量瓶,用甲醇溶解并定容,得AA和GA贮备液质量浓度1 g·L-1。4 ℃保存,3个月安稳。

精细移取GA贮备液1 mL置25 mL量瓶中,用甲醇定容,摇匀得40 mg·L-1的GA溶液。别离精细移取AA贮备液适量和上述GA溶液25 μL置枯燥试管中,氮气吹干,残渣用50 μL空白胆汁混匀,按232项处理,终究制成AA质量浓度为1,2,5,10,20,40,80 mg·L-1的系列溶液。同法制备质控样品质量浓度为2,10,40 mg·L-1。

234HPLC办法的树立与验证

2341色谱条件参阅已树立的办法[6]进行:色谱柱 Diamonsil C8(46 mm×150 mm,5 μm);活动相甲醇乙腈(1∶1)(A),水(B);梯度洗脱:0~10 min,25% B;10~25 min,11%~25% B,25~28 min,25% B;流速10 mL·min-1;柱温25 ℃;检测波长248 nm;进样量20 μL。

2342办法学点评选用梯度洗脱测定胆汁中的药物浓度,AA保存时刻在11 min左右,GA保存时刻20 min左右,空白胆汁中的内源性杂质对两者检测均无搅扰,显现杰出的专特点(图2)。以AA质量浓度Y(mg·L-1)为纵坐标,AA与GA峰高的比值X为横坐标,得线性回归方程Y=4949X+0219(r=0999 5),显现AA在1~80 mg·L-1线性关系杰出。办法的日内、日间精细度均<5%,办法回收率>90%,AA与内标的提取回收率均>80%(表1)。

235吸收动力学数据剖析

胆汁分泌率核算公式:

胆汁分泌率(μg·h-1)=各时刻段胆汁分泌量/t

使用药物核算软件(PKS 10, Shanghai Magnsoft Consulting)核算药动学参数,药物峰浓度Cmax和达峰时刻tmax为实测值,分泌速率时刻曲线下面积(AUC0t)经过梯形法核算得到。选用SPSS 190核算剖析软件进行t查验。

236大鼠口服纳米粒后的吸收动力学

取大鼠灌胃AANLC或pAANLC后搜集的胆汁样品适量,经酶解、液液提取富集等技能,选用HPLC办法检测不同时刻段胆汁中的药物总浓度。

成果显现,脂质纳米粒经PEG亲水性润饰后,胆汁中Cmax明显进步(进步76%,P<001),达峰时刻tmax有所减慢,消除半衰期t1/2延伸1倍,AUC0t为润饰前的15倍(表2)。胆汁中总AA分泌速率时刻曲线(图3),AANLC经PEG润饰后,体内停留时刻大大延伸,药物水平有了明显进步,24 h累计分泌量较润饰前添加了50%(图4)。

3评论

对NLC进行外表润饰,首要考虑纳米外表的亲水亲脂性、外表电荷及空间特性等要素的影响。粒子外表亲脂性越强,吞噬细胞对其吞噬才能也越大,因而本研讨以低分子量的PEG2000SA为资料对纳米粒进行外表润饰,改进其亲水性,以削减吞噬细胞的辨认与吞噬。因为SA链与脂质资料有杰出的相容性,可作为亲脂端刺进到纳米粒的中心,而具有必定柔韧性的PEG链作为亲水端处于纳米粒的外表,伸向水中,使纳米粒的空间结构也发作改动,一方面使粒子间发作足够大的斥力,进步粒子的安稳性而不集合,另一方面,也可以阻挠蛋白质的吸赞同逃避网状内皮体系的捕捉,延伸纳米粒在体内的循环时刻,进步生物利费用[1011]。别的,NLC首要依托细胞吸取进行转运,经润饰后的NLC细胞旁路途径转运会有较大的添加,转运途径的改动,也或许影响药物吸收[13]。

AA经肠道吸收后,在肝脏发作二相代谢,首要代谢产品为葡醛酸结合物和硫酸酯结合物,且以胆汁途径分泌为主[14]。本研讨经过树立清醒大鼠胆汁引流模型,检测胆汁中AA的总浓度可直接反映药物在体内的吸收动力学。本文比较了PEG润饰前后纳米粒的小肠吸收散布与胆汁分泌特征,发现纳米粒的亲水性增大,可明显进步小肠黏膜的透过才能,大大延伸药物体内停留时刻,进步药物水平,进一步改进口服生物利费用,为新式纳米制剂的开发使用供给了根据。

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[责任编辑张燕]

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